여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.
유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)는 인간 개발과 질병을 공부 하는 유용한 도구가 될을 입증 했다. Ipsc를 재생으로 치료를 진행 하 고 더 안전 하 고, 강력한, 및 편법 재활 프로토콜 필요 합니다. 여기, 선물이 Ipsc 비 통합 방식을 사용 하 여에 인간 피부 섬유 아 세포의 매우 높은 효율 프로그래밍에 대 한 임상 관련, 단계별 프로토콜. 프로토콜의 핵심 표현 pluripotency 요인의 구성 (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4 MyoD 퓨전) 생체 외에서 베낀된 메신저 RNAs를 합성에서 뉴클레오티드 (수정 된 mRNAs) 수정. 재활 수정된 mRNAs는 2 주 동안 기본 fibroblasts 성숙한 배아 줄기 세포 관련 예측에 관한-367/302 모방 함께 모든 48 h에 페. 결과 iPSC 식민지 수 있습니다 다음 격리 되며 직접 급지대 무료 조건에서 확장. 섬유 샘플을 효율성과 우리의 재활 프로토콜의 일관성을 최대화 하려면 우리 RNA transfection 처방을 포함 한 다양 한 매개 변수를 최적화 transfections, 문화 조건 및 시드 밀도의 타이밍. 중요 한 것은, 우리의 메서드는 원본의 대부분 섬유, 어려운 재 병, 세, 또는 노화 샘플을 포함 하 여 높은-품질 Ipsc를 생성 합니다.
유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)로 체세포를 재프로그래밍 pluripotency1,2를 유지 하는 중요 한 녹음 방송 요인의 핵심 집합의 확장된 식이 필요 합니다. Ipsc 임상 응용 프로그램에 대 한 생산 때 처리 하는 동안 입력된 셀에 mutational 부담 최소화 및 iPSC 생성의 효율성은 환자 샘플에서 상대적으로 높은 수준에서 유지에 필수적 이다. 그러나, 프로그래밍 통합 무료 프로토콜을 포함 하 여 방법의 대부분은 매우 낮은 재활 효율성, 이러한 제한 임상 유용성 있는 접근3에서 겪고 있다. 낮은 재활 효율 또한 기존 돌연변이, 결과 Ipsc mutational 부담 증가 운반 하는 세포의 선택적 프로그래밍 홍보 수 있습니다. 또한, 모든 DNA 기반 재활, 같은 방법을 lentivirus 및 episomal 기반 접근, DNA 수 있습니다 무작위로 게놈으로 통합 하 고 유해한 insertional mutagenesis와 원치 않는 (에 대 한 기회를 만드는 안전 관심사에서 고통 다운스트림 조직 파생 상품4pluripotency 유전자의 잠재적으로 종양) 식입니다.
유망한 접근 pluripotency 체세포에서의 효율적인 유도 달성 하 고 결과 Ipsc mutational 부담을 줄이기 위해 합성 출장된 메신저 RNAs를 사용 하는 nucleobases (수정 된 mRNAs)5프로그래밍에 대 한 수정 포함. 수정 된 mRNA 기반 재활 접근의 효율성은 배아 줄기 세포 (ESC)를 추가 하 여 더 강화 될 수 있다-특정 microRNAs (miRNAs)-367/302s3체세포와 함께 프로그램을 표시 되었습니다 증가 효율6 ,7. 그러나, miRNAs-367/302s의 추가 함께 수정된 mRNA 기반 재활 접근은 종종 갓 격리 환자 세포3응용 프로그램 중 실패합니다. 이 수정 된 mRNA 기반 방식의 주소 불일치, 하 우리는 최근 보고 pluripotency 높은 성공률과 함께 인간의 기본 fibroblasts에 유도 하 고 인코딩 두 수정 된 mRNAs를 활용 하는 최적화 된, 통합 무료 전략 프로그래밍 요소와 성숙한 미르-367/3028을모방 합니다. 우리의 방법에 칵테일 재활 수정된 mRNA OCT4 MyoD transactivation 도메인 (M3O 라는)9 와 다른 5 개 재활 요인 (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, 및 NANOG) 융합의 수정된 된 버전을 포함 합니다. 미르와 pluripotency 요인 인코딩 수정된 mRNA 결합 모방 프로그래밍이 프로토콜의 효율성에 시너지 효과가 나타났다. RNA transfection 처방의 추가 최적화 셀 시드, 그리고 자란 조건 했다 또한 초고 레벨8에 접근의 재활 효율성을 증가 하는 데 필요한.
다른 많은 프로토콜 달리 재활 접근에만 몇 천 입력된 fibroblasts를 일반적으로 필요합니다. 또한, 많은 일반적인 비 통합 전략 episomal 플라스 미드를 사용 하 여, 센다이 바이러스, 또는 각자 복제 RNA 포함 광범위 한 재활 벡터 생성된 Ipsc에 희석을 뿌리고. 반대로, 수정 된 mRNA와 성숙한 미르 모방 짧은 반감기를가지고 빠르게 셀에서 제거 됩니다. 함께 찍은 환자 샘플 및 사용 가능한 Ipsc의 세대 수집 사이 누적 셀 문화 시간이이 접근, 효과적으로 결과 Ipsc 돌연변이 축적을 제한 하 고 비용 효율성 개선에서 최소 이다.
여기, 우리는 Ipsc 우리의 조합 수정된 mRNA/miRNA 기반 접근8를 사용 하 여에 성인 인간 섬유 아 세포의 재프로그래밍 하는 높은 효율을 달성 하기 위해 자세한 단계별 프로토콜을 제시. 이 RNA 기반 재활 프로토콜 연구와 잠재적인 임상 응용 프로그램에 대 한 통합 무료 Ipsc를 생성 하기 위한 비용 효율적인, 간단 하 고 강력한 방법을 제공 한다. 또한, 그것은 세, 그리고 노화 섬유 아 세포 등 어려운-하-재, 질병 관련 된 섬유 아 세포 라인의 다양 한의 프로그래밍에 적용 됩니다. 인간 섬유 아 세포를 재 프로그램에 대 한 프로토콜의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜은 특별히 인간 성인 기본 섬유 아 세포 형식 6-잘 접시에서의 3 개의 우물을 프로그래밍 하는 방법을 설명 합니다. 두 웰 스는 일반적으로 높은-품질 iPSC 식민지의 충분 한 수 양보. 많은 경우에, 단 하나 잘 필요한 이며 세 번째 잘 프로그래밍 효율 분석에 사용할 수 있습니다. 필요한 경우에 우물의 수 확장할 수 있습니다.
이 프로토콜 Ipsc는 매우 높은 효율로 일반 및 질병 관련 인간의 섬유 아 세포 라인의 프로그래밍에 대 한 수 임상 관련, 비 통합, RNA 기반 방법을 설명 합니다. 날짜 하려면, 모든 인간의 섬유 아 세포 선 우리 설명 프로토콜 프로그램을 시도 했습니다 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 높은-품질 Ipsc의 만족 수를 굴복 했다. 결과 Ipsc 즉시 전송 하 고 지류 무료 문화 조건에 확장 수 있습니다.
프로그래밍에 대 한 섬유 아 세포의 품질:
프로그래밍 성공 하는 것은 시작 하는 섬유 아 세포의 품질에 크게 의존입니다. 이상적으로, 프로그래밍 최고의 효율을 달성 하기 위해 사용할 수 있는 가장 낮은 통행 fibroblasts와 함께 시작 되어야 합니다. 효율을 프로그래밍 하는 것은 통로 2-4의 섬유 아 세포와 가장 좋습니다. 프로그래밍 사용할 수 있습니다 여전히 높은 통로 (통로 5-8), 심지어 노화 섬유 아 세포, 효율을 감소와 함께 쓰 신. 때로는 낮은 통로 섬유 아 세포는 사용할 수 없습니다 또는 환자 샘플 건강 한 성장을 방지 하는 유전 돌연변이. 이 경우에, 초기 도금 밀도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 손상 된 섬유 아 세포 라인의 프로그래밍 하는 것은 일반적으로 RNA transfections 동안 증가 세포 죽음 연관 된다. 그 결과, 잘 프로그래밍에 셀 프로그래밍 10-14 일 스파스 될 나타납니다. 또한 대형 acellular 지역에는 잘 표시 되지 것입니다. 이 경우 재활 프로토콜 수 섬유 아 세포의 더 높은 초기 시작 번호를 다시 시작 해야 합니다. 형식 6-잘 접시의 당 3000 입력된 셀 도금 가장 성인 섬유 아 세포 라인에 대 한 일관 되 게 작동 합니다. 그러나, 5000-10000 (노화 라인에 대 한 50000) 도금 수 우리의 이전 게시8에서 보고 된 질병 관련 된 샘플의 프로그래밍을 개선 하기 위해 도움이 됩니다. 반대로, 세포 confluency를 너무 일찍 도달 프로그래밍에 저항력이 될 수 있습니다. 경우 셀 RNAs를 프로그래밍으로 transfections를 받고 너무 급속 하 게 확산 (로 때때로 주 신생아 섬유 아 세포의 경우), 형식 6-잘 접시8의 당 500 fibroblasts와 프로그래밍 시작.
Transfection 버퍼의 처리:
Transfection 버퍼 (8.2의 pH를 조정 하는 감소-혈 청 매체)의 pH 프로토콜 프로그래밍이 필요한 최적의 transfection 효율을 달성 하는 최고 이다. 이러한 이유로, transfection 버퍼의 처리에 관한 몇 가지 예방 조치는 것이 좋습니다. 우리는 대기 공기에도 짧은 노출 transfection 버퍼의 버퍼의 pH에 영향을 발견 했다. 따라서, transfection 버퍼 (우리는 5 또는 15 mL 나사 모자 원뿔 관 사용) 최소한의 공기 공간 스크류 캡 용기에 aliquoted 이어야 한다. 추가 공기 노출 최소화, 2 개의 transfections의 최대 각 transfection 버퍼 aliquot을 사용 합니다. 마지막으로, 온도 영향 pH, 이후 transfection 버퍼 transfection 단지의 어셈블리에 대 한 rt equilibrated은 중요 하다. 37 ° c transfection 버퍼 따뜻한 하지 하는 것이 좋습니다.
Ipsc의 뿌리고.
많은 이전 프로토콜 추천 개별 iPSC 식민지 프로그래밍의 끝을 따기에 출판, 그러나이 프로그래밍의 효율성은 매우 높은 또는 식민지 클러스터 함께 있는 경우로 하는 경우를 달성 하기 어려울 수 있습니다 우리의 프로토콜입니다. 따라서, iPSC 식민지 서로 가까이에 있다면, 먼저 뿌리고 셀 수동으로 식민지를 따기 전에 재설정된 Ipsc 밖으로 확산 하는 것이 좋습니다. 이 이른 통행 단계를 수행 하는 것 몇 가지 이점이 있다. 식민지에 밖으로 퍼지는 그들이 제공 성장, 더 많은 공간에 원래 잘 달성 될 수 있었다 그렇지 않으면 보다 따기에 대 한 훨씬 더 큰 식민지를 양보 합니다. 이 크게 고른된 클론에서 iPSC 라인에서 성공률을 향상 시킵니다. 우리는 또한 섬유 아 세포와 함께 추가 문화 시간 희석된 비율에도 불구 하 고 나타나는 고른된 iPSC 식민지의 평균 품질을 개선 하기 위해 찾으십시오. 불완전 하 게 재설정된 fibroblasts 지원 paracrine 요소는 Ipsc를 설정 하 고 셀 피더-무료 문화 조건으로 직접 전환을 쉽게 도움을 계속 제공할 수 있습니다. 섬유 아 세포는 우연히 Ipsc mTeSR1에서 경작 하는 경우에 비해 선택적 성장 단점이 있다. 따라서, 오염 fibroblast 세포 인구는 3-4 구절 내에서 무시할 수 수량을 신속 하 게 희석 된다.
Y-27632 등 록 억제제 인간의 Ipsc의 일상적인 문화에 자주 사용 됩니다. 우리는 자주 또는 확장 문화 Y-27632와 일부 iPSC 라인의 전반적인 품질에 해로운 효력이 있을 수 있다을 발견 했다. 덩어리 뿌리고 메서드를 사용 하 여 같은 EDTA와 Y-27632 않습니다 분한 후 iPSC 생존 능력을 유지 하는 데 필요한. 우리 완전히 모든 iPSC 격리, 확장, 또는 일상적인 문화에 대 한 Y-27632와 보충 미디어를 제거 했습니다.
프로토콜 제한 사항:
설명된 RNA 기반 재활 접근 한 제한은 초기 비용과 복잡성 재활 시 약의 준비와 관련 된입니다. 시 약은 모든 루틴 및 이전 되었습니다 mRNA를 생성 하는 준비 절차 설명 (PCR, 녹음 방송 생체 외에서 DNase 치료, 상한, dephosphorylation, 정화), 누적 mRNA 시 약의 생산은 상대적으로 길고 특수 과정입니다. 이 프로토콜을 다른 주요 도전 transfect 세포 마다 48 h, 재활 프로토콜의 노동 강도 증가 하는 필요 이다. 이러한 고려 사항 몇 환자 샘플의 프로그래밍은 원하는 경우 금지 있을 수 있습니다. 그러나, 1 차 배려 임상 관련 Ipsc 또는 매우 높은 재활 효율 달성의 세대 이면 설명된 RNA 기반 재활 접근 이상적입니다.
요약, 설명된 고효율 RNA 기반 재활 방법 우리의 이전 게시8에 설명 된 대로 재설정 체세포 형식의 최적화 transfection 효율에 경첩. 이 연구에서 제시 하는 RNA transfection 프로토콜 인간의 기본 fibroblasts에 대 한 높은 조정 하지만 잠재적으로 다양 한 체세포의 재활 효율 향상을 위해 다른 셀 형식에 맞게 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 건강의 국가 학회 (T32AR007411-33)와 콜로라도 대학 피부 질병 연구 핵심 센터 (P30AR057212)에서 지원 자금에 대 한 감사. 우리는 또한 선 피 (EB) 연구 협력, EB 의료 연구 재단, 치료 EB 자선, Dystrophic 선 피 연구 협회 (데 브라) 국제, 킹 보두앵의 Vlinderkindje 기금, 재단과 게이츠 감사 프론티어 기금입니다.
Plasmid templates for PCR | |||
pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
DNase I | NEB | M0303S | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
Fibroblast culture and reprogramming | |||
0.1% Gelatin in H2O | stemcell technologies | #07903 | |
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
iPSC culture | |||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
Antibodies and Detection | |||
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
Special Equipment | |||
Description | Notes | ||
Biological safety cabinet | |||
Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37°C. | ||
Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37°C. Use for the reprogramming procedure. | ||
pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |