Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Hayvanlarla ilgili tüm çalışmalar Mayo Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak yapılmıştır. 1. Tezgah Hazırlama Bir su banyosu hazırlayın ve 37 °C’ye ayarlayın. Diğer gerekli ekipman ve kurulum Şekil1’de gösterilmiştir. Ölçü 100 kollajenaz tip IV mg ve bir su banyosu (40 °C) HBSS 100 mL içeren 125 mL şişe ekleyin. Kollajenazşişedeki sıvıyı girerek çözünmüş olduğundan emin olun ve ayrıca şişenin tamamen su banyosuna batırıldığından emin olun. Daha fazla verimlilik için, kollajenaz anında çözülmek gibi görünse bile en az 30 dakika erimesine izin verin. 40 °C’deki bir su banyosunda 50 mL HBSS içeren 125 mL’lik bir şişeyi sulayın. Bu ilk yıkama için kullanılacaktır. % 70 etanol ile makas ve forceps gibi tüm araçların yüzeyini aşağı sprey. Birkaç temiz pamuklu bez hazırlayın. Pompa nın üzerinden etanol çalıştırarak pompanın borularını durulayın ve akan suyla iki kez durulayarak artık etanolleri çıkarın. Laboratuvar bankına emici bir tezgah pedi yerleştirin ve üstüne sert bir kutu kabı yerleştirin. Bu fare perfüzyon sırasında herhangi bir aşırı sıvı lar içermek için gerekli olacaktır. Alüminyum folyo ile bir polistiren köpük ped sarın ve konteyner içine yerleştirin. Tezgahın yakınına 10 cm’lik steril bir kültür çanağı yerleştirin. Bu perfüzyon tamamlandıktan sonra sindirilmiş karaciğer tutmak için kullanılacaktır. Önceden steril bir kültür çanağı içine kollajenaz orta (adım 1.2) 10 mL dökün. Kanatlı kan toplama seti kullanarak, pompa boru serbest ucuna 23-gauge bağlayın (kelebek kanül kapalı kanatları kesme daha iyi işleme yol açabilir). Kan toplama kanülünün ucu dolana kadar geçirin. 2. Hayvan Hazırlığı Isoflurankullanarak anesteziye başlamadan önce, işlem süresince yeterli miktarda besleme gazı nın mevcut olduğundan emin olun. Oksijeni (O2)indüksiyon odasına 1-2 L’de açın, ardından akış ölçer kullanarak isofluran’ı %2-4 arasında açın. Fareyi indüksiyon odasına koyun ve üst kapıyı kapatın. Fareyi bükülene kadar izleyin.NOT: Odadaki gazlar fareleri birkaç dakika boyunca anestezi altında tutar. Fareyi alüminyum folyo ile sarılmış polistiren köpük pedüzerine yerleştirin. Akışı indüksiyon odasından nosecone’a çevirin. Anestezinin yeterli olduğundan emin olun. Fare yanıt vermeye başladıysa, tamamen anestezi yapılana kadar burun konisi içinde hafifçe dizginle. İşlem sırasında solunum uyup uyarıma yanıt vererek anesteziyi sağlayın. Yeterli anestezi sağlamak için hız akış ölçerini gerektiği gibi ayarlayın. Patiler anestezi altında çimdik testine yanıt vermemelidir. Hayvanların bakımı için laboratuvar rehberinden ek bilgi alınabilir. Farenin dört uzvunu da bantlayın veya sabitleyin. % 70 etanol ile püskürtme ve gazlı bez ve alkol pedi ile silerek karın üzerinde cilt temizleyin. Bu adım, fare kürkünden kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir. Steril makas seti kullanarak ön den pelvis kemiğine kadar deri ile geniş bir açık kesim olun. İç organları kesmemeye dikkat edin. Portal ven (PV) ve inferior vena kava (IVC) nazikçe ortaya çıkarmak için hafifçe bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak hayvanın sol tarafına bağırsak yerinden. 3. Kanülasyon ve Perfüzyon (0.5 saat) Kavisli forceps kullanarak, portal ven altında bir iplik yerleştirin ve kanülasyon sonra sıkıca cinching hazırlamak için gevşek bir düğüm kravat. Kanülleri (kan toplama setinden 23G) ligatür altında portal vene 5-10 mm takın. Kanülilk portal dalı geçmiş eklemeyin, aksi takdirde sağ ön lob yetersiz perfüzyon olabilir. Kanül bir stoper düğümü kullanılarak iş parçacığı ile sabitlenebilir veya sabitlenebilir. Düşük akış hızında (1-2 mL/dk) HBSS’ye aşılamak için pompayı çalıştırın. Kanülasyonun başarılı olduğu doğrulandıktan sonra karaciğer beyazletmeye başlayacaktır. Basıncı azaltmak ve karaciğer içinde aşırı sıvı drenaj izin IVC kesin. Bu, kanülün taşınmaması için diğer el işleçler kullanılarak en iyi şekilde gerçekleştirilir. Akış hızını yavaşça 8 mL/dk’ya yükseltin ve sonraki 5 dk boyunca karaciğer de HBSS’nin 50 mL’lik hacminin tamamını kullanarak perfüzyonu tamamlayın. HBSS tükenmeye başlamadan hemen önce orta içeren kollajenazı (adım 1.2) kabın içine değiştirin. Hava kabarcıklarının bulunmadığından ve ortamı değiştirirken karaciğere akmayan dan emin olun. Forceps ile kenetlenerek 5 s aralıklarla IVC’ye geçici basınç uygulayın. Bu karaciğer şişmesine neden olur ve doku sindirim ve dissociation (7-8 dk) ile yardımcı olur. Sindirim ilerledikçe, karaciğer şişecek ve beyaz olacak. Karaciğer, orijinal boyutunun yaklaşık iki katı kadar tek tip olarak şişebilir. Pompayı kapatın ve sindirim tamamlandıktan sonra kanülçıkarın. Karaciğer sindirim tamamlanması fare nin boyutu na ve karaciğer durumuna bağlıdır. Bir pamuk uçlu aplikatör yavaşça karaciğer probe için kullanılırsa karaciğerde bir ezik görülebilir. Karaciğerden safra kesesi çıkarın, onu yırtmak için dikkatli olmak. Yıkanmış bir makas ve forseps kullanarak, yüzey yıkama için fosfat tamponlu salin (PBS) içeren steril 10 cm kültür çanak içine fareden karaciğer ayıklayın. Karaciğeri kollajenaz orta içeren steril 10 cm kültür kabına dikkatlice aktarın (adım 1.8’den). Bu fare kan ve safra kontaminasyonu önlemek için kritik bir adımdır. Kapmak ve yavaşça karaciğer hücreleri sallayarak iki temiz forceps ile karaciğer parçalamak. Bu durumda, ortam bulanıklaşır. Tüm hepatositler sarsılabilir, bağ dokusu ve vasküler doku geride bırakarak. Karaciğerin sindirilmemiş parçaları sarsılın kadar 3 mL şırınga kullanarak birçok kez hücre çözeltisi triturate. Sindirilmemiş bağ dokusunu filtrelemek için 70 m naylon hücreli süzgeçlerle birlikte 50 mL konik bir tüpe dökün. Kalan hücreleri toplamak ve 50 mL konik tüp doldurmak için HBSS ile çanak yıkayın. Santrifüj 50 mL konik boruyu 4 °C’de 10 dk boyunca 50 x g’da sallanan bir kova rotorunda hafifçe yerleştirin. Supernatant’ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. 4. EV Izolasyonu (5 saat) 4 °C’de 10 dk için 300 x g’de süpernatantı santrifüj edin. Supernatant’ı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. Hücre enkazını ve agregalarını temizlemek için 2000 x g’de 4 °C’de 20 dk’da süpernatantı santrifüj edin. Supernatant’ı yuvarlak bir alt tüpe aktarın ve supernatant’ı 4°C’de 70 dk için 10.000 x g’de santrifüj edin. Supernatant toplayın ve 4 °C’de 70 dakika için 100.000 x g bir polikarbonat ultracentrifuge tüp ve santrifüj içine yerleştirin. Daha sonra PBS yeniden askıya alınarak yıkanır bir ultracentrifuge tüp pelet toplamak. 4 °C’de 70 dk için 100.000 x g’de süpernatantı daha fazla santrifüj edin. Hücresel nanoveziküllerden oluşan son pelet deneyler için doğrudan kullanılabilir veya 1000 μL PBS ile yeniden askıya alınabilir ve -80 °C’de depolanabilir. 5. İzolasyonların Kalite ve Veriminin Değerlendirilmesi Nanopartikül izleme analizi veya cihaz üreticisinin protokollerini izleyerek dayanıklı darbe algılamasını kullanarak boyut dağılımını ve konsantrasyonu değerlendirin. Belirli deneysel ihtiyaçlara dayalı olarak sakaroz gradyan veya yastık, immünaffinite teknikleri veya boyut dışlama kromatografisi gibi çeşitli yaklaşımlarla spesifik vezikül popülasyonlarının daha fazla izolasyonve saflaştırılmasını gerçekleştirin.