Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Alle studies waarbij dieren werden betrokken, werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat werd goedgekeurd door de Mayo Clinic institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité. 1. voorbereiding van de Bank Maak een waterbad en stel het in op 37 °C. De andere benodigde apparatuur en opstelling worden weergegeven in Figuur 1. Meet 100 mg Collagenase type IV en voeg het toe aan een kolf van 125 mL die 100 mL HBSS bevat in een waterbad (40 °C). Zorg ervoor dat de Collagenase is opgelost door de vloeistof in de kolf te zwengelen en zorg er ook voor dat de kolf volledig in het waterbad wordt ondergedompeld. Voor een grotere efficiëntie, laat de collagenase te ontbinden voor ten minste 30 min, zelfs als het lijkt te ontbinden onmiddellijk. Dompel een kolf van 125 mL met 50 mL HBSS in een waterbad van 40 °C onder. Dit wordt gebruikt voor de initiële Flushing. Spuit het oppervlak van alle instrumenten zoals de schaar en de Tang met 70% ethanol. Maak een paar schone wattenstaafjes. Spoel de slang van de pomp uit door de pomp met 70% ethanol uit te voeren en verwijder eventuele rest ethanol door het tweemaal met stromend water te spoelen. Leg een absorberend Bank blok op de labbank en plaats een harde doos container bovenop. Dit is nodig om overtollige vloeistoffen te bevatten tijdens de perfusie van de muis. Wikkel een piepschuim pad met aluminiumfolie en plaats het in de container. Plaats een steriel 10 cm kweek schaaltje dicht bij de Bank. Dit zal worden gebruikt om de verteerde lever te houden nadat de perfusie is voltooid. Giet van tevoren 10 mL Collagenase medium (stap 1,2) in een steriel kweekbakje. Met behulp van een gevleugelde bloedverzamelset, Verbind de 23-gauge met het vrije uiteinde van de pomp slang (het snijden van de vleugels van de vlinder canule kan leiden tot een betere handling). Pas de punt van de canule van bloedinzameling is gevuld. 2. voorbereiding van dieren Voordat u begint met anesthesie met behulp van isoflurane, zorg ervoor dat er een voldoende hoeveelheid levergas beschikbaar is voor de duur van de procedure. Zet de zuurstof (O2) toevoer naar de inductie kamer op 1-2 L, schakel vervolgens Isofluraan tussen 2-4% met behulp van een debietmeter. Plaats de muis in de inductie kamer en sluit de bovenste deur. Controleer de muis totdat deze is liggend.Opmerking: de gassen in de kamer houden de muizen verdomiliseerd gedurende enkele minuten. Plaats de muis op een polystyreen schuim pad verpakt met aluminiumfolie. Schakel de stroom van de inductie kamer naar een nosecone. Zorg ervoor dat anesthesie voldoende is. Als de muis is begonnen te reageren, voorzichtig te onderdrukken in een neuskegel tot de het volledig anesthetized. Zorg voor anesthesie door het bewaken van de ademhaling en reactie op stimulatie tijdens de procedure. Pas de rate flowmeter zo nodig om voldoende anesthesie te garanderen. De poten moeten niet reageren op de knijp test onder verdoving. Aanvullende gegevens kunnen worden verkregen uit de laboratorium gids voor de verzorging van dieren. Plak of speld alle vier de ledematen van de muis. Reinig de huid over de buik door te spuiten met 70% ethanol en veeg het af met gaas en een alcoholdoekje. Deze stap is essentieel om besmetting van de muis vacht te voorkomen. Maak een wijd open snede door de huid van de voorste naar het bekken bot met behulp van een set steriele schaar. Let op dat u geen inwendige organen snijdt. Verplaats de darmen naar de linkerzijde van het dier met behulp van een katoen getipt applicator om zachtjes de portaal ader (PV) en de inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen. 3. cannulatie en perfusie (0,5 h) Met behulp van gebogen Tang, plaats een draad onder de poortader en bind een knoop losjes om te bereiden strak na de cannulatie. Plaats de canule (23G uit de bloedverzamelset) in de portaal ader 5-10 mm onder de ligatuur. Plaats de canule niet langs de eerste portaal vertakking, anders kan de rechter voorste kwab onvoldoende geperfectiongebruikt worden. De canule kan worden bevestigd of met draad worden vastgemaakt met een Stop knoop. Start de pomp om de HBSS met een laag debiet te insmelten (1-2 mL/min). Zodra de cannulatie is bevestigd om succesvol te zijn, zal de lever beginnen te blancheer. Snijd de IVC om de druk te verlichten en laat overmatige vloeistof binnen de lever te drain. Dit wordt het best uitgevoerd met behulp van de andere hand van de operators, zodat de canule niet wordt verplaatst. Verhoog langzaam de stroomsnelheid tot 8 mL/min en voltooi de perfusie met het volledige 50 mL volume HBSS via de lever, gedurende de volgende 5 minuten. Verander de Collagenase met medium (stap 1,2) in het bekerglas vlak voordat de HBSS begint te lopen. Zorg ervoor dat luchtbellen niet aanwezig zijn en niet in de lever stromen bij het verwisselen van het medium. Breng een voorbijgaande druk aan op de IVC met een interval van 5 sec. door te klemmen met een tang. Dit zal leiden tot de lever zwellen en helpen met weefsel spijsvertering en dissociatie (7-8 min). Naarmate de spijsvertering vordert, zal de lever zwellen en wit worden. De lever kan gelijkmatig opzwellen tot ongeveer tweemaal de oorspronkelijke grootte. Zet de pomp uit en verwijder de canule zodra de spijsvertering is voltooid. De voltooiing van de lever spijsvertering zal afhangen van de grootte van de muis en de toestand van de lever. Een deuk in de lever kan worden waargenomen als een katoen getipt applicator wordt gebruikt om zachtjes sonde de lever. Verwijder de galblaas uit de lever, voorzichtig zijn om het niet te scheuren. Gebruik een gewassen schaar en een tang, haal de lever uit de muis in een steriele 10 cm kweek schaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor oppervlakte wassen. Breng de lever voorzichtig over in de steriele 10 cm kweek schaal met collagenase medium (uit stap 1,8). Dit is een cruciale stap voor het voorkomen van besmetting van de muis bloed en Gal. Pak en scheur de lever uit met twee schone Tang en schud de cellen voorzichtig van de lever. Als dit gebeurt, zal het medium worden vertrooneerd. Alle hepatocyten kunnen worden weggeschud, waardoor het bindweefsel en het vaatweefsel achterblijven. Triturate de cel oplossing vele malen met behulp van een 3 mL spuit totdat de niet-verteerde delen van de lever worden geschud. Giet het af in een conische buis van 50 mL met 70 μm nylon celstrainers om onverteerd bindweefsel te filteren. Was de schaal met HBSS om de resterende cellen te verzamelen en vul de conische buis van 50 mL. Centrifugeer zachtjes de conische buis van 50 mL in een draaiende emmer rotor bij 50 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng de supernatant over naar een nieuwe conische buis van 50 mL. 4. isolatie van EVs (5 uur) Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Breng het supernatant over in een nieuwe conische buis van 50 mL. Centrifugeer het supernatant bij 2000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c om celresten en-aggregaten te verwijderen. Breng de supernatant over naar een ronde bodem buis en Centrifugeer het supernatant bij 10.000 x g voor 70 min bij 4 °C. Verzamel de supernatant en plaats in een polycarbonaat ultracentrifuge buis en centrifugeer bij 100.000 x g voor 70 min bij 4 °C. Verzamel de pellet in een ultracentrifuge buis die vervolgens wordt gewassen door opnieuw te suspenseren in PBS. Centrifugeer het supernatant verder op 100.000 x g voor 70 min bij 4 °C. De laatste pellet bestaande uit cellulaire nano blaasjes kan direct worden gebruikt voor experimenten of opnieuw worden opgehangen met 1000 μL PBS en opgeslagen bij-80 °C. 5. beoordeling van de kwaliteit en het rendement van isolaties Evalueer de grootteverdeling en de concentratie met behulp van nanodeeltjes tracking analyse of instelbare resistieve Pulsdetectie volgens de protocollen van de fabrikant van het instrument. Verdere isolatie en zuivering van specifieke vesikelpopulaties uitvoeren door verschillende benaderingen, zoals de toevoeging van een sacharose gradiënt of kussen, immunoaffiniteits technieken, of grootte uitsluitings chromatografie, gebaseerd op specifieke experimentele behoeften.