HUVEC 튜브 형성 분석은 혈관 신생에 천연 물의 영향을 평가하기 위해
Summary
여기서, 우리는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석을 사용하여 혈관 네트워크 형성에 루타 graveolens의 물 추출물의 효과를 평가한다.
Abstract
혈관 신생은 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 몇몇 신호 전광 통로를 관련시키는 내피 세포 증식, 분화 및 이동과 같은 다른 프로세스를 포함하는 현상입니다. 여기에서 우리는 관 형성 분석이 혈관 신생에 천연물의 충격을 평가하고 관련시킨 분자 기계장치를 조사하기 위하여 간단한 시험관 내 방법이다는 것을 보여줍니다. 특히, 루타 자갈렌즈(RGWE)의 물 추출물이 존재할 때, 내피 세포는 더 이상 세포 세포를 형성할 수 없으며 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC) 튜브 형성에 대한 RGWE 효과가 폐지되는 데에는 MEK의 구성 활성화.
Introduction
혈관 신생은 기존의 혈관에서 새로운 혈관의 형성으로 이끌어 내고 배아 발생 및 기관 성장 도중 생기는 생리적인 프로세스입니다. 성인기에서 혈관 신생은 사이클링 난소, 임신 중 태반, 상처 치유 및 수리 중에만 활성화됩니다. 혈관 신생은 내피 세포가 증식, 분화 및 이동하는 능력에 따라 달라지며 그대로 혈관네트워크를 형성합니다 1. 그러나 염증성, 대사 성 및 류마티스 질환과 같은 여러 장애에서 혈관 신생 과정이 변경되고 혈관 신생이 과도해집니다. 더욱이, 통제되지 않는 혈관신생 프로세스는 또한 종양진행 및 전이를 자극합니다 1. 이러한 이유로, 지난 10년간, 연구연구는 암, 안구, 관절 또는 피부 질환에서 과도한 혈관신생의 억제를 목표로 하는 새로운 치료 전략의 개발에 초점을 맞추고있다2,3.
혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 현재 항혈관신생 요법 4의 주요표적을 나타내며, 과도한 혈관신생을 방지하기 위해 여러 개의 항-VEGF 단일클론 항체가 개발 및 합성되고 있다. 그러나, 이러한 합성 약물은 심각한 부작용을 보이고 불리한 비용대 이익 비율을 가지고 5,6. 따라서, 보완하고 현재 사용되는 약물과 결합하는 최소한의 부작용으로 과도한 혈관 신생을 제한하는 새로운 치료 전략을 찾는 것이 필수적이다. 이러한 새로운 약물은 높은 화학적 다양성과 생화학적 특이성을 특징으로하는 천연 제품 중에서 찾을 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는 시험관에서 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브를 형성하는 HUVECs의 능력에 RGWE의영향을 평가하는 간단한 방법을 제안한다 5. 실제로, RGWE는 루틴이 주요성분인가운데 플라보노이드 및 폴리페놀과 같은 이차 대사산물의 혼합물이다. 그들 중 많은 사람들이 이미 항 염증 및 혈관 보호 제 7,8,9,10,11로테스트되었습니다. 더욱이, 우리는 최근에 RGWE, 그러나 루틴이 아니라, 겔화된 지하 매트릭스에 관을 형성하는 HUVEC 능력을 억제할 수 있고 이 현상이 MEK-ERK 통로에 의해 중재된다는 것을, RGWE를 잠재적인 치료 도구로 나타낼 수 있다는 것을 증명했습니다 과도 한 새로운 혈관 형성을 방지5.
Protocol
Representative Results
Discussion
천연 화합물은 높은 화학적 다양성 및 생화학적 특이성을 특징으로 하며 잠재적으로 치료 분자의 공급원을 나타낸다. 여기서, 우리는 식물 R. graveolens에서 물 추출물을 얻는 방법을 보여주고 혈관 형성 분석법을 수행하기 쉽고 신뢰할 수 있으며 혈관 신생에 대한 RGWE의 효과를 조사하는 데 유용한 정량적 방법으로 제안합니다. 완전한 물 추출물을 얻으려면 R. graveolens 잎을 1 시간 동안…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 마리아 테레사 이방인과 AIRC 펀드 IG18999 마우리치오 비풀코에 루카 콜루치 – 다마토와 발레 프로그램 기금에 폰디 디 아테네에 의해 투자되었다.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro Models of Angiogenesis. World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
