מערכת שפופרת HUVEC להערכת השפעת מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה
Summary
כאן, אנו להעריך את ההשפעות של תמצית המים של רוטה הקבר על היווצרות הרשת באמצעות שימוש בשיטת היווצרות צינור על מטריצה מרתף ג.
Abstract
אנגיוגנזה היא תופעה הכוללת תהליכים שונים, כגון הפצת תאים אנדותל, בידול והגירה, המובילה להקמת כלי דם חדשים ומערבת מספר מסלולים של אותות התמרה. כאן אנו מראים ששיטת היווצרות הצינורות היא דרך פשוטה להעריך את ההשפעה של מוצרים טבעיים על אנגיוגנזה ולחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים. בפרט, בנוכחות תמצית המים של רוטה האלגני (rgwe), תאי האנדותל אינם מסוגלים עוד ליצור רשת תא תא וכי השפעות rgwe על תא הטבור האנושי (huvec) היווצרות שפופרת בוטלה על ידי ה הפעלה חוקתית של מק.
Introduction
אנגיוגנזה הוא תהליך פיזיולוגי המוביל להיווצרות כלי דם חדשים מקיימים ומתרחש במהלך צמיחת embryogenesis ואיברים. בבגרות, אנגיוגנזה מופעל רק בשחלה רכיבה על אופניים, השליה במהלך ההריון, במהלך ריפוי פצעים ותיקון. אנגיוגנזה תלוי ביכולת של תאי האנדותל להתרבות, להבדיל ולהגר ליצירת רשת כלי דם מלאה1. עם זאת, במספר הפרעות, כגון מחלות דלקתיות, מטבולית ושגרונית, תהליכי אנגיוגנטיים משתנים ואנגיוגנזה הופך להיות מוגזם. יתר על כן, תהליכים אנגיוגנטית מבוקרת גם לעורר התקדמות הגידול גרורות1. מסיבות אלה, בעשור האחרון, לימודי מחקר מתמקדים בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות שמטרתן עיכוב של אנגיוגנזה מוגזם בסרטן, בעינית, במפרק, או בהפרעות בעור2,3.
גורם הגדילה של כלי הדם (מהווה את המטרה העיקרית של הטיפולים הקיימים אנטי-אנגיוגנטיים4, ומספר נוגדנים אנטי-וסקולריים שפותחו ומסונתז כדי למנוע אנגיוגנזה מוגזם. עם זאת, תרופות סינתטי אלה להראות תופעות לוואי חמורות יש יחס שלילי לתועלת הרווח5,6. לכן, זה הכרחי למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי להגביל אנגיוגנזה מוגזם עם תופעות לוואי מינימליות כדי להשלים ולשלב עם סמים המשמשים כיום. תרופות חדשות אלה ניתן למצוא בין מוצרים טבעיים המאופיינת מגוון כימי גבוה וספציפיות הביוכימי.
במאמר זה, אנו מציעים שיטה פשוטה כדי להעריך את ההשפעה של RGWE על היכולת של HUVECs ליצור tubules על מטריצה מרתף g, מבחנה5. אכן, rgwe הוא תערובת של מטבוליטים משני כגון פלאונואידים ו פוליפנולים ביניהם רוטין הוא המרכיב העיקרי5. רבים מהם נבדקו כבר כסוכנים אנטי דלקתיים ובעלי מצבר7,8,9,10,11. יתר על כן, לאחרונה הדגמנו כי rgwe, אבל לא rutin, הוא מסוגל לעכב את היכולת huvec ליצור tubules על מטריצה מרתף g, כי תופעה זו מתווכת על ידי מסלול מק-טיפשה, המציין rgwe ככלי טיפולי פוטנציאלי מסוגל ל למנוע היווצרות כלי דם חדש מוגזמת5.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרכובות טבעיות מתאפיינות בגיוון כימי גבוה ובחומרים ביוכימיים ומייצגים מקור למולקולות טיפוליות בפוטנציה. כאן, אנו מראים כיצד להשיג תמצית מים מהמפעל R. קברות ולהציע את שיטת היווצרות הצינור כשיטה קלה לביצוע, אמין, כמותית שימושי כדי לחקור את ההשפעות של rgwe על אנגיוגנזה. חשוב להרתיח את העל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי Fondi di Ateneo כדי לוקה קולוצ-דאמאטו ו VALERE תוכניות קרנות למריה תרזה גויים ו AIRC קרן IG18999 למיאוריציו Bifulco.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro Models of Angiogenesis. World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
