Agrobacterium 중재 변환 꽃 딥 메서드를 사용 하 여 성공적으로 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula의 안정적인 유전자 변형 라인을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 선물이 프로토콜에서 애기 thaliana, 다른 성장 습관을 고려 하 고는 extremophyte의 생리 적 특성에 대 한 수정.
Schrenkiella parvula 는 여러 이온 독성 스트레스를 포함 하 여 다양 한 abiotic 스트레스에 적응 하는 extremophyte입니다. 높은-품질 게놈 자원을 사용할 수 있는도 불구 하 고 식물 환경에 적응 하는 방법을 공부를 강조, 기능 유전체학 모델 값 고 도구 가능한 변환 시스템의 부족에 의해 제한 되어 있다. 이 프로토콜에서 우리는 안정적인 유전자 변형 미 parvula 를 생성 하는 방법을 보고 Agrobacterium 중재 꽃 딥 방법을 사용 하 여 라인. 우리는 A. thaliana 불확정 꽃 습관 등 잎에 높은 epicuticular 왁 스 콘텐츠 S. parvula의 독특한 특성에 대 한 계정에 사용 하는 변환 프로토콜을 수정 합니다. 간단히, S. parvula 씨앗 심기 전에 5 일 동안 4 ° C에서 층 화 되었다. 식물 photoperiod 14 h 빛과 어둠 10 h과는 130 µmol m-2s-1 빛의 강도, 22 ° C 24 ° c에서 성장 했다 8 9 주 된 식물 여러 inflorescences 변환에 대 한 선정 됐다. 이러한 inflorescences Agrobacterium tumefaciens GV3101의 pMP90RK 플라스 미드를 들고 침투 솔루션에서 감소 했다. 우리는 꽃 찍기 변환 효율을 높이기 위해 3 ~ 4 주 간격으로 2 라운드를 수행. T1 씨앗 수집 하 고 후보에 대 한 화면 발 변형 라인 전에 방와 컨테이너에 4 주 동안 건조 했다. 그만하 라고 저항 T1 식물에 사용 되었다. 우리는 가양성을 줄이기 위해 2 주 된 식물에서 시작 하는 3 일 간격으로 세 번 그만하 라고 솔루션을 살포. 그만하 라고 드롭 테스트 살아남는 진정한 긍정적인 transformants를 식별 하기 위해 개별 공장에서 수행 되었다. 변환 효율 0.033%, 10000 T1 씨앗 전파 당 3-4 유전자 변형 식물을 양보 했다.
이 프로토콜에서 성장 및 extremophyte 모델 Schrenkiella parvula에 대 한 안정적인 유전자 변형 라인의 설립을 설명합니다. 효율적인 변환 시스템의 가용성은 어떤 다양 한 유전자 모델의 특징 이다. 극한 환경에서 번 창 하는 식물 extremophytes, 식물 환경 스트레스에 적응을 이해 하기 위한 중요 한 리소스 제공 이라고 합니다. Schrenkiella parvula (이전 Thellungiella parvula , Eutrema parvulum) 게놈 자원1,2,3,,45를 확대와 함께 한 같은 extremophyte 모델입니다. 그러나, 변환 프로토콜 하지 아직 보고 되었습니다 S. parvula 에 대 한 게시 된 연구.
S. parvula 의 게놈 십자화과 (겨자 양배추 가족)에 첫 번째 게시 된 extremophyte 게놈 이며 비 extremophyte 모델, 애기 thaliana1광범위 한 전체 게놈 synteny를 보여줍니다. 따라서, A. thaliana S. parvula 사이 비교 연구 A. thaliana 어떻게 parvula S. 게놈 진화 있으며 규제에 유익한 가설을 수행 하는 유전자 연구의 재산에서 혜택을 수 있는 다르게 대처에 극단적인 환경5,,67강조 합니다. S. parvula 는 가장 소금 관대 (토양 NaCl LD50 기준) 알려진된 야생 친척 중의 종 A. thaliana8중 하나입니다. NaCl 내성 이외 S. parvula 통과 대부분 식물7독성 높은 농도에서 여러 소금 이온의 존재 그것의 수명 주기를 완료. 그것의 자연 서식 지에서 널리 퍼진 abiotic 스트레스에 대응, 그것 중 여러 연구에서 생화학 또는 생리 적 레벨 8,,910, 다양 한 특성을 진화 했다 11.
2010 년부터 대상 종으로 S. parvula 를 사용 하거나 다른 식물 게놈 비교에 사용 하는 400 개 이상의 피어 reveiwed 게시 되었습니다. 그러나, 분명 병목 어떤 유형의 연구를 실시 했습니다의 면밀 한으로 확인 될 수 있습니다. 대부분의 이러한 보고서의 미래 연구에 S. parvula 의 잠재적인 사용을 논의 하거나 비교 genomic 또는 phylogenomic 연구에서 그것을 사용 하 여. 개념 증명 변환 프로토콜의 부족으로 인해 설립 S. parvula에 대 한 날짜에 사용할 수 있는 최고 품질 식물 게놈의 한이 있는도 불구 하 고 기능 게놈 연구에 사용 되지 않은 (> 5 Mb contig N50) 조립 및 염색체 수준 pseudomolecules1에 주석을 답니다.
Agrobacterium 중재 꽃 dip 변환 방법 A. thaliana에서 trasngenic 라인을 만드는 가장 광범위 하 게 사용 되는 방법은 되고있다 그리고 변환의 재현 시스템의 개발은으로 그것의 성공에 중요 한 요소는 유전자 모델12,13. 그러나, 모든 십자화과 종 A. thaliana개발 꽃 딥 방법을 사용 하 여 변환 성공적으로 표시 되었습니다. 특히, S. parvula 를 포함 하는 십자화과 리니지 II 종 꽃-딥 기반된 변환 방법14,15고집 불통 되었습니다.
S. parvula, 그것의 좁은 잎 형태와 결합의 불확정 꽃 성장 습관 도전 표준 Agrobacterium 중재 꽃 딥 변환 방법을 채택 했다. 이 연구에서 우리는 수정 된 프로토콜 S. parvula의 재현성 변화에 대 한 개발 했습니다 보고 합니다.
식물의 생리 적 상태 변환25의 효율을 크게 영향을 줍니다. 변환에 대 한 건강 하 고 활기찬 식물의 사용 S. parvula에서 성공적인 변환에 대 한 주요 요구 사항입니다. 물 또는 가벼운 스트레스 식물 변환 (그림 1, 센터 패널)에 대 한 이상적인 건강 한 식물에 비해 적은 꽃 있을 것 이다. S. parvula 는 빛의 강도에 성장할 수 있는 보다 작은 130 µmol m<su…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 과학 재단 수상 MCB 1616827에 의해 지원 되었다.
Agar | VWR International, Radnor, PA | 90000-762 | Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics |
B5 vitamins | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1019 | Gamborg’s Vitamin Solution |
Desiccant | W A Hammond Drierite, Xenia, OH | 22005 | Indicating DRIERITE 6 mesh |
Destination vector for plant transformation | TAIR | Vector:6531113857 | pKGWFS7 |
Electroporation cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | Electroporation cuvette, round cap, 0.2 cm gap |
Electroporator | BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA | 1652100 | MicroPulser Electroporator |
Fertilizer beads | Osmocote Garden, Marysville, OH | N/A | Osmocote Smart-Release Plant Food Flower & Vegetable |
Gel extraction kit | iNtRON Biotechnology, Boston, MA | 17289 | MEGAquick-spin Total fragment DNA purification kit |
Gentamicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1914-5G | Gentamicin sulfate |
Glufosinate-ammonium (11.3%) herbicide (BASTA) | Bayer environmental science, Montvale, NJ | N/A | FINALE herbicide |
Kanamycin | VWR International, Radnor, PA | 200004-444 | Kanamycin monosulfate |
MES | Bioworld, Dublin, OH | 41320024-2 | MES, Free Acid |
MS salt | MP Biomedicals, Santa Anna, CA | 092621822 | Hoagland's modified basal salt mixture |
N6-benzylaminopurine (BA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B3274 | 6-Benzylaminopurine solution |
NaCl | Sigma-Alrich | S7653 | Sodium chloride |
Non-ionic detergent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 9005-64-5 | TWEEN 20 |
Plasmid isolation kit | Zymo Research, Irvine, CA | D4036 | Zyppy Plasmid Kits |
Recombinase enzyme mix kit | Life Technology | 11791-020 | Gateway LR Clonase II Enzyme mix |
Rifampicin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | R3501-1G | Rifampicin, powder, >= 97% (HPLC) |
Shaking incubator | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA | SHKE4450 | MaxQ 4450 Benchtop Orbital Shakers |
Soil mix | Sun Gro | SUN239223328CFLP | Sun Gro Metro-Mix 360 Grower Mix |
Spectinomycin | VWR International, Radnor, PA | IC15206705 | |
Sterile 50ml conical tubes | USA Scientific, Ocala, FL | 1500-1811 | 50 ml conical screw cap tubes, copolymer, racks, sterile |
Sucrose | VWR International, Radnor, PA | 57-50-1 | Sucrose, ACS |
Surfactant solution | Lehle seeds, Round Rock, TX | VIS-02 | Silwet L-77 |
Topoisomerase-based cloning kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | K240020 | pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
Tryptone | VWR International, Radnor, PA | 90000-282 | BD Bacto Tryptone, BD Biosciences |
Yeast Extract | VWR International, Radnor, PA | 90000-722 | BD Bacto Yeast Extract, BD Biosciences |