利用 tap 标签纯化叶绿体转移蛋白配合物的亲和纯化

1. 拟南芥植物的制备 制备1升半强度的 murashige 和 skoog (ms) 培养基, 包括1% 蔗糖的维生素, 并调整 ph 值与氢氧化钾 (koh) 5.7。在120°c 下加入0.8% 的植物琼脂和高压灭菌器20分钟。 每个 petri 板 (直径14.5 厘米, 高3厘米) 倒75毫升 ms 介质, 并允许凝固1小时。 将30 毫克的拟南芥种子加入1.5 ml 微泡管中, 用含有 0.05% (v/v) 的70% 乙醇进行表面消毒 5分钟, 然后用 100% (v/v) 乙醇10分钟。 将种子转移到无菌滤纸上进行干燥。将灭菌种子均匀地撒在 ms 板上 (每个基因型至少需要8-10 个板), 并用手术胶带密封每个盘子。 在4°c 的温度下, 在黑暗中将盘子生两天, 使种子同步发芽。转移到具有以下光循环的生长室: 8小时120μmol-2秒- 1 光,在22-20 时的16h 暗。 2. hsigg 琼脂糖珠的制备 将 cnbrm 激活的琼脂糖珠 (4 克) 悬浮在 1 mm hcl 的 100 ml 中, 在室温下孵育30分钟。 将琼脂糖珠转移到烧结玻璃过滤器中, 用 100 mm hcl 的100毫升真空清洗, 重复2-3 次。注: 将洗涤液前至4°c。 将琼脂糖珠在1毫升冷 100 mm hcl 中再利用, 转移到50毫升锥形离心管中。用 100 mm hcl 的3毫升清洗烧结玻璃滤清器, 并将液体转移到同一管中。 在4°c 下, 在 400xg下旋转 5分钟, 并用移液器取出上清液。注: 请勿将管子装饰。 在耦合缓冲液的50毫升中重新拔插磁珠 (表 1);简单混合, 然后在4°c 下在400xg 下旋转5分钟。 在偶联缓冲液的10毫升中溶解50毫克的冻干智人 igg (hs-igg), 轻轻混合琼脂糖珠, 在4°c 的旋转振动台中隔夜孵育。 在4°c 下, 在 400xg下旋转 5分钟, 并用移液器取出上清液。 用50毫升的耦合缓冲液清洗 igg 琼脂糖珠, 在 400xg下旋转 5分钟, 4°C。 用50毫升的阻滞缓冲液 (表 1) 重新扫描 igg 琼脂糖珠, 在4°c 下在 400xg下旋转5分钟。重复一次。 在50毫升的阻滞缓冲液中重新旋转 igg-agsregsic 珠, 在 rt 旋转混合物 2小时, 在 4°c 时旋转 400xg 5分钟。 取下上清液, 在氯化钠偶联缓冲液200毫升中重新悬浮 IgG-agarose 珠 (表 1)。 为了阻止任何剩余的交联 cnbr 基团, 请用 0.1 m 甘氨酸-hcl 的100毫升清洗 igg-agleads阳性珠, ph 值2.8。在4°c 下, 在 400xg下旋转 5分钟, 并取出上清液。用 0.2 m 甘氨酸-hcl 清洗, ph 2.8, 在4°c 时在 400xg下旋转 5分钟, 并去除上清液。最后, 用200毫升的超纯水清洗 igg-琼脂糖珠。 用200毫升的超纯水和200毫升的 pbs 缓冲液清洗 igg 琼脂糖珠 (表 1)。 将 IgG-agarose 珠在20毫升的 pbs 缓冲液中, 用 0.01% nan3 (氮化钠) 进行再利用, 并在4°c 下储存。 3. 膜分数的分离和溶解 用冷砂浆和带沙子的将10周大的幼苗在液氮中磨碎。 在10克地面组织中加入20毫升的冷磨缓冲液 (表 1), 搅拌均匀, 在冰上解冻。 通过两层快速过滤材料将均质体过滤到50ml 锥形离心管中。过滤前, 用研磨缓冲液浸泡快速过滤材料。 在4°c 条件下, 在 1500xg处离心滤液 10分钟, 并将上清液转移到冷却的50毫升锥形离心管中, 再重复一次相同的步骤, 收集上清液。保留 “总分数” 的200μl 样品, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析 将上清液转移到冷 38.50 ml 超离心管, 并使用冷磨缓冲液顶部至 35 ml。在超离心机中以 100, 000xg 的温度在4°c 下离心 1小时. 将上清液转移到50毫升锥形离心管上。保留200μl 的 “可溶性分数” 样品, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。 在研磨缓冲液中, 使用玻璃聚四氟乙烯均质机重新悬浮绿色颗粒。在超离心机中以 100, 000xg 的温度在4小时内离心 1小时, 并丢弃上清液. 使用玻璃聚四氟乙烯均质机在1x 研磨缓冲液的 18.75 ml 中重新注入绿色颗粒, 并加入 9.375 ml 的1x 研磨缓冲液。 加入9.375 毫升的4倍溶解性溶液 (表 1) (包含 tx-100 洗涤剂), 在4x 的 “旋转振动台” 上给予 37.5 ml 和孵育30分钟。 在超离心机中以 100, 000xg 的温度在4°c 下离心 1小时. 将上清液转移到50毫升锥形离心管上。保留上清液的200μl 样品 (未来的 “负载分数”), 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。 在 37.5 ml 的研磨缓冲液中重新弹性颗粒。将不溶性部分的样品保存在-80°c 4. 免疫沉淀 在缓冲区 a 中平衡100μl 填充 igg 琼脂糖树脂 (表 1), 在4°c 时在 100xg 下旋转5分钟。 在4°c 下, 取出上清液, 在100μl 的缓冲 a 中重新悬浮 igg-琼脂糖树脂。 将清洗后的 igg-ags糖树脂转移到 37.5 ml 的溶解性膜中, 在4°c 的50毫升锥形离心管中, 在旋转振动台上孵育一夜。 在4°c 条件下, 将 igg 琼脂糖树脂沉积 100xg 5分钟, 并用移液器去除上清液。保留200μl 样品的 “流经”, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。 在缓冲 a 的 37.5 ml 中清洗 igg-琼脂糖树脂, 在旋转振动台孵育10分钟。 在4°c 下, 将 igg-琼脂糖树脂沉积在100xg 下 5分钟, 用移液器去除上清液, 在100xg、4°c、5分钟的15毫升离心管和离心机中加入5毫升研磨缓冲液 a, 保留200μl 的 “清洗 1” 样品, 存放在-80°c供以后分析。 使用缓冲区 a 重复 5次5毫升清洗步骤。 在没有抑制剂的情况下执行最后两个清洗步骤 (naf、蛋白酶抑制剂和 pmsf)注: 在此阶段不再需要抑制剂, 也无需降低成本。保留最后清洗步骤 “最终清洗 (w6)” 的200μl 样品, 并存储在-80°c, 以便以后进行分析。 将 igg-琼脂糖树脂转移到具有35μm 过滤器的500μl 自旋柱上, 并用300μl 的 tev 洗脱缓冲液 (表 1) (不含 actev) 清洗珠子两次, 以进行平衡。关闭旋转列。 加入300μl 的 tev 洗脱缓冲液, 其中包含50个单位 (10μl) 的 actev。在加入树脂之前, 先在管子中加入混合物。 在16°c 时, 用珠子在热敏仪中培养自旋柱, 每隔 30分钟350转每分钟 2小时, 轻轻将柱倒置几次。 打开旋转柱, 将其放入一个新的清洁 1.5 ml 管中, 在4°c 下以100xg 旋转 5分钟, 以收集洗脱液。 干燥 (例如) 10% (v/v) 的洗脱样品 (~ 25μl) 在离心蒸发器和用于质谱或其他进一步分析。 将剩余的洗脱液 (~ 275μl) 分成 11 1.5 ml 离心管 (每管 25μl), 在离心蒸发器中干燥, 并储存在-80°c。 分析在整个过程中保留的样品, 以及通过标准 sds-page 进行分析, 然后进行免疫印迹。对于样品制备, 沉淀50微克的 total (t)、load (l)、fk)、洗涤 1 (w1) 和200μl 洗涤6(w6), 通过氯甲酸/甲醇萃取16。 在沉淀样品和25μl 的洗脱干燥样品中加入10μl 的 2x sds-page 装载缓冲液 (表 1)。在95°c 的高温下, 在热块中产生涡流并煮沸10分钟。 通过使用抗肿瘤抗体进行免疫印迹分析总 (t)、负载 (l)、流经 (ft)、清洗 1 (w1)、洗涤 6 (w6) 和洗脱 (e), 以确定分离过程的效率。