انجذاب تطهير المجمعات البروتين ترانسلوكون بلاستيدات الخضراء باستخدام علامة الحنفية
Summary
ونقدم هنا بروتوكول المجربة والمختبرة لتنقية بلاستيدات الخضراء البروتين استيراد المجمعات (مجمع عرة TOC) باستخدام علامة الحنفية. البروتوكول والعزل تقارب خطوة واحدة يحتمل أن يمكن تطبيقها على أي البروتين ويستخدمها الكتلي التعرف على شركاء جدد من التفاعل.
Abstract
نشوء حيوي بلاستيدات الخضراء يتطلب استيراد الآلاف من البروتينات المرمزة بنواة إلى البلاستيديه. استيراد هذه البروتينات يعتمد على ترانسلوكون الخارجي (TOC) وأغشية بلاستيدات الخضراء (عرة) الداخلية. جدول المحتويات والتشنج المجمعات مولتيميريك وربما تحتوي على مكونات غير معروفة حتى الآن. أحد الأهداف الرئيسية في هذا المجال وضع قائمة جرد كاملة لمكونات جدول المحتويات والتشنج. لعزل مجمعات عرة جدول المحتويات، وتحديد مكونات جديدة، مستقبلات بريبروتين TOC159 وقد تم تعديل ن لا شفاء منه بإضافة علامة تنقية (وات) تقارب جنبا إلى جنب أسفر عن الحنفية-TOC159. اضغط العلامة مصممة لتنقية تقارب متسلسلة خطوتين (وبالتالي “تقارب جنبا إلى جنب”). علامة برنامج المشورة التقنية المستخدمة في هذه الدراسات تتكون من الطرفي ن مفتش ملزمة المجال المستمدة من البروتين المكوّرات العنقودية الذهبية (بروتا) يتبع طريق ببتيد كالمودولين-الملزمة (الجمارك). بين هذه العلامات تقارب اثنين، أحفر التبغ الانقسام حوزتي الفيروس (TEV) وقد أدرج الموقع. ولذلك، يمكن استخدامها حوزتي TEV شطف لطيف من المجمعات التي تحتوي على TOC159 بعد ملزم الخرز مفتش. في البروتوكول المعروضة هنا، تم حذف الخطوة تنقية كالمودولين-تقارب الثانية. البروتوكول تنقية يبدأ مع إعداد و solubilization مجموع الأغشية الخلوية. بعد المنظفات-العلاج وهي المحتضنة بروتينات الغشاء solubilized مع الخرز مفتش إيمونويسوليشن المجمعات التي تحتوي على TOC159 اضغط. عند الربط والغسيل واسعة النطاق، المشقوق الصنبور-TOC159 التي تحتوي على مجمعات وأفرج عنه من الخرز مفتش حوزتي TEV حيث يتم إزالة المجال س المذهبة مفتش ملزمة باستخدام. الغربية النشاف من عزلة يمكن استخدامها المجمعات التي تحتوي على TOC159 للتأكد من وجود بروتينات جدول المحتويات والتشنج المعروفة أو المشتبه فيها. الأهم من ذلك، المجمعات التي تحتوي على TOC159 قد استخدمت بنجاح لتحديد مكونات جديدة من المجمعات جدول المحتويات والتشنج من الطيف الكتلي. يسمح البروتوكول الذي نقدم يحتمل أن كفاءة عزل أي بروتين غشاء زمنياً المعقدة التي ستستعملها الكتلي للتعرف على مكونات غير معروفة حتى الآن.
Introduction
النباتات تعتمد على المعايشة لعملية التمثيل الضوئي والنمو فوتواوتوتروفيك1. الغالبية العظمى من البروتينات بلاستيدات الخضراء هي مرمزة في النواة وتوليفها في سيتوسول واستيرادها بلاستيدات الخضراء عن طريق المجمعات عرة وجدول المحتويات في الأغشية مغلف2. ويتألف جوهر جدول المحتويات المعقدة القناة البروتين-إجراء Toc75 وهما مستقبلات Toc33 جتباسيس Toc1593،،من45. TOC159 ضروري لنشوء حيوي للمعايشة ويتوسط التراكم الهائل من البروتينات المرتبطة بعملية التمثيل الضوئي6. ويتكون المجمع عرة قناة البروتين-إجراء TIC20، فضلا عن7،TIC110 و TIC408. مؤخرا، بروتين 1MD إزفاء معقدة في الغشاء المغلف الداخلية كانت معزولة ويتضمن عناصر مجهولة سابقا9، كان أحدها TIC56. مؤخرا نحن معزولة شارك TIC56 من 1 نجمة داود الحمراء معقدة استخدام بروتوكول تنقية تقارب الصنبور-TOC159. وتشير البيانات إلى تداخل هيكلي بين المجمعات جدول المحتويات/تيك “المتعارف عليه” و مجمع جمعية نجمة داود الحمراء 110. سابقا كما تم تحديد المكونات غير معروفة مثل KOC1 كشركاء جدد في التفاعل من المجمعات جدول المحتويات والتشنج استخدام الصنبور-الأسلوب الموصوفة هنا10،11.
وهكذا، تنقية الحنفية العلامة طريقة فعالة لعزل البروتين المجمعات وتحديد الشركاء المتفاعلة ب التحليل الشامل والمطيافيه اللاحقة12. علامة الحنفية يتألف اثنان يكرر ملزمة مفتش يفصلها عن ببتيد كالمودولين-الملزمة (الجمارك) التبغ أحفر الفيروس (TEV) مبطلات الانقسام والموقع. الأسلوب الأصلي، تتألف من خطوة تنقية تقارب مفتش متبوعاً بانشقاق TEV واللوني اللاحقة كالمودولين-تقارب يسمح بتنقية أصلية كبيرة ونقية عالية البروتين المجمعات13،14 . لدينا تبسيط الإجراءات وأثبتت أن مجمعات البروتين التي تحتوي على TOC159 يمكن أيضا أن تنقية كفاءة استخدام فقط الخطوة تنقية تقارب مفتش تليها الانقسام TEV شطف15. في تجربتنا، إغفال الخطوة كالمودولين-تقارب أدت إلى زيادة الغلات ولذلك قد يكون مناسباً للبروتينات وفرة منخفضة.
وباختصار، نحن المهندسة وراثيا مستقرة التمويل (أ) خطوط معربا عن الصنبور–TOC159 في ppi2 (toc159 كو المسخ) الخلفية والمنشأة فإنه كمصدر موثوق لتطهير المجمعات عرة جدول المحتويات. البروتوكول المتعلق بعزل المجمع عرة TOC يبدأ بتجانس المواد النباتية في منطقة عازلة خالية من المنظفات. بعد الطرد المركزي، يتم تجاهل المادة طافية. هو solubilized بيليه الذي يحتوي على الكسر غشاء مجموع استخدام المخزن مؤقت الذي يحتوي على مواد التنظيف. بعد خطوة فائقة-الطرد المركزي، يتم تطبيق المادة طافية المحتوية على سولوبيليزيد جدول المحتويات-تيك المجمعات على راتنج مفتش لانجذاب تطهير. بعد عدة خطوات الغسيل، شطف يجري استخدام المخزن مؤقت الإجمالية المحتوية على مبطلات لانتقائية تنشق المصب من المجالات الملزمة مفتش ولطف الإصدار الأصلي المجمعات التي تحتوي على TOC159. يمكن تحليل النذرة TEV مباشرة بواسطة النشاف الغربية أو الكتلي تحديد الشركاء التفاعل TOC15910،،من1115. كما استخدمت الطريقة لتحديد التعديلات بوستترانسلاشونال TOC15915. في المستقبل، قد تستخدم المجمعات الأصلية التي تحتوي على TOC159 لدراسات الهيكلية باستخدام الفحص المجهري كريويليكترون.
Protocol
Representative Results
Discussion
أظهرنا أن خطوة واحدة تنقية العلامة الصنبور طريقة محددة وفعالة لتنقية المجمع عرة TOC نبات . على الرغم من أن علامة الحنفية سيسمح خطوتين تنقية المتعاقبة (مفتش-تليها كالمودولين انجذاب تطهير بعد TEV البروتياز-الانقسام)، ونعتقد أن تقارب خطوة أولى تليها TEV حوزتي الانقسام ستكون كافية في العديد من الحالات. أن هدفنا، TOC159، هو منخفض وفيرة وإدراج الخطوة الثانية كالمودولين-تقارب مفرطة تناقص الغلة البروتين الذي كان السبب الرئيسي لاستبعاد أنه لدينا هذا البروتوكول. TEV-شطف في حد ذاته هو خطوة محددة جداً ولطيف وتنقية ستفرج فقط المستهدفة الصنبور معلم جنبا إلى جنب مع الشركاء المرتبطين بها التفاعل بينما تلويث البروتينات في التمسك بعدم التحديد الراتنج مفتش ستبقى هناك. وهكذا، في تركيبة مع خطوة تقارب مفتش، يؤدي شطف TEV على تنقية فعالة بما فيه الكفاية لأغراض لدينا وربما العديد من الآخرين.
يجب الحرص أن بناء معلم الحنفية تعمل بكامل طاقتها في فيفو. يمكن أن يكون وضع علامات على الاستفادة من الآثار الضارة المحتملة على نشاط البروتين أو الاستقرار أو التعريب. TOC159 تتألف من ثلاثة مجالات، المجال الطرفي ن الحمضية، والمركزي أنشئ ملزمة المجال والمجال غشاء ج-الطرفية، المراسي TOC159 في الغشاء الخارجي بلاستيدات الخضراء2. لتجنب التداخل المحتمل مع الإدراج غشاء، نحن تنصهر علامة الحنفية إلى N-محطة TOC159. الانصهار إلى N-المحطة هو الاستثناء بدلاً من القاعدة. العديد من البروتينات تحتوي على معلومات تستهدف الطرفي ن، وينبغي لذلك معلم في ج-المحطة. أكد لنا أن TOC159 الوظيفية في فيفو بالتكامل للمسخ ppi2 (المسخ ألبينو تفتقر إلى TOC159) مع الاستفادة من TOC159. إنقاذ الأخضر، أوضحت البرية نوع النمط الظاهري أن الحنفية-TOC159 الفنية15.
وكان استخدام البروتوكول تنقية التعرف على شركاء جدد من التفاعل من TOC159، التي شملت10،KOC1 و TIC5611. وفي المجموع، ترتبط البروتينات حوالي 30 مع المجمع مما يوحي بأن التفاعل الجديدة سيتم عزل الشركاء وتتميز في المستقبل القريب. بينما نوصي بشدة علامة برنامج المشورة التقنية لتنقية معقدة، لا تزال نود أن نشير إلى أن إصدارات إضافية لتلك المقدمة هنا موجودة، وقد يكون من المفيد جداً لبعض التطبيقات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان دعم العمل من المنح المقدمة من “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية” (31003A_156998 و 31003A_176191)، وجامعة نيوشاتيل.
Materials
| NaHCO3 | PanReac AppliChem | A0384 | |
| Tris | Biosolve | 0020092391BS | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7909 | |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | A2946 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | A2942 | |
| NaF | Sigma | S1509 | Toxic |
| PMSF | PanReac AppliChem | A0999 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | A0970 | |
| Triton X100 | Roche | 10789704001 | |
| Glycine | PanReac AppliChem | A1067 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043 | |
| Dithiothreitol (DTT) | PanReac AppliChem | A1101 | |
| SDS | PanReac AppliChem | A0675 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B0126 | |
| HCl | VWR | 20252-290 | Corrosive |
| Sucrose | PanReac AppliChem | A3935 | |
| Murashige and Skoog medium with vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Phytoagar | Duchefa Biochemie | P1003 | |
| Petri plate | Greiner Bio-one | 639102 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706 | |
| Ethanol | Fisher chemical | E/0600DF/15 | |
| Filter paper | Whatman | 10311804 | |
| Surgical tape | 3M | 1530-1 | |
| CNBr-Activated agarose beads (sepharose 4B) | GE Healthcare | 17-0430-01 | |
| Sintered glass filter | DURAN | 2515703 | |
| Centrifuge tube 50 mL | TPP | 91050 | |
| Purified immunoglobulin G (HsIgG) | MP Biomedicals | 855908 | |
| Rotating shaker | IKA | 4016000 | |
| NaN3 (sodium azide) | Sigma | 71290 | Toxic |
| Quick filtration material (Miracloth) | Merk-Millipore | 475855 | |
| Ultracentrifube XNP-80 | Beckman Coulter | A99839 | |
| Rotor SW 32 Ti | Beckman Coulter | 369650 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Glass teflon homogenizer (Potter) | Wheaton | 357426 | |
| Spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M1003 | |
| Filter 35µm for spin column (Mobicol) | Mo Bi Tec | M513515 | |
| AcTEV | Invitrogen | 12575-015 | |
| Centrifugal evaporator (Speed Vac) | Eppendorf | 5305000100 | |
| FBN1A(PGL35) antibody | AgriSera | AS06 116 | RRID:AB_2247012 |
| Sand, Fontainebleau | VWR | 27460.295 |
References
- Jarvis, P., López-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Kessler, F., Schnell, D. Chloroplast biogenesis: diversity and regulation of the protein import apparatus. Current opinion in cell biology. 21 (4), 494-500 (2009).
- Schnell, D. J., Kessler, F., Blobel, G. Isolation of components of the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1007-1012 (1994).
- Kessler, F., Blobel, G., Patel, H. A., Schnell, D. J. Identification of two GTP-binding proteins in the chloroplast protein import machinery. Science. 266 (5187), 1035-1039 (1994).
- Jarvis, P., et al. An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science. 282 (5386), 100-103 (1998).
- Bauer, J., et al. Essential role of the G-domain in targeting of the protein import receptor atToc159 to the chloroplast outer membrane. The Journal of cell biology. 159 (5), 845-854 (2002).
- Kovacs-Bogdan, E., Soll, J., Bolter, B. Protein import into chloroplasts: the Tic complex and its regulation. Biochimica et biophysica acta. 1803 (6), 740-747 (2010).
- Nakai, M. The TIC complex uncovered: The alternative view on the molecular mechanism of protein translocation across the inner envelope membrane of chloroplasts. Biochimica et biophysica acta. 1847 (9), 957-967 (2015).
- Kikuchi, S., et al. Uncovering the protein translocon at the chloroplast inner envelope membrane. Science. 339 (6119), 571-574 (2013).
- Kohler, D., et al. Characterization of chloroplast protein import without Tic56, a component of the 1-megadalton translocon at the inner envelope membrane of chloroplasts. Plant physiology. 167 (3), 972-990 (2015).
- Zufferey, M., et al. The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery. The Journal of biological chemistry. 292 (17), 6952-6964 (2017).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Rohila, J. S., Chen, M., Cerny, R., Fromm, M. E. Improved tandem affinity purification tag and methods for isolation of protein heterocomplexes from plants. The Plant journal. 38 (1), 172-181 (2004).
- Rohila, J. S., et al. Protein-protein interactions of tandem affinity purified protein kinases from rice. PloS one. 4 (8), 6685 (2009).
- Agne, B., et al. The acidic A-domain of Arabidopsis TOC159 occurs as a hyperphosphorylated protein. Plant physiology. 153 (3), 1016-1030 (2010).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
