Cryosectioning simultanea di più cervelli roditore
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per congelare e sezione di tessuto cerebrale da più animali come alternativa ad alta produttività per singoli cervelli di elaborazione. Questo riduce la variabilità di colorazione durante immunohistochemistry e imaging e tempo cryosectioning.
Abstract
Istologia e immunohistochemistry sono metodi di routine di analisi per visualizzare l’anatomia microscopica e localizzare le proteine all’interno dei tessuti biologici. In neuroscienze, così come una pletora di altri campi scientifici, queste tecniche sono utilizzate. Immunohistochemistry può essere fatto su tessuto scivolo montato o sezioni digalleggiante. Preparazione dei campioni montata è un processo intensivo di tempo. Il seguente protocollo per una tecnica, denominata Megabrain, ridotto il tempo necessario al tessuto cerebrale donatrici e Monte fino al 90% combinando più cervelli in un unico blocco congelato. Inoltre, questa tecnica ridotta variabilità visto tra turni, in un grande studio istochimico di colorazione. La tecnica attuale è stata ottimizzata per l’utilizzo di tessuto cerebrale dei roditori nelle analisi immunohistochemical a valle; Tuttavia, può essere applicato a diversi ambiti scientifici che utilizzano cryosectioning.
Introduction
Qui, presentiamo il protocollo per un metodo novello, che noi chiamiamo Megabrain, sviluppato per donatrici roditore più cervelli contemporaneamente per procedure immunohistochemical a valle. Un Megabrain consente la produzione di singole diapositive che contiene il tessuto da più animali. Questa tecnica è stata ottimizzata per tagliare sezioni coronali da 9 emisferi di ratto adulto, o 5 cervello adulto completo, contemporaneamente. Pertanto, la tecnica è più applicabile in studi immunohistochemical grande o altre analisi fatto sul tessuto cerebrale montata da un grande gruppo degli animali.
Immunohistochemistry implica l’uso di anticorpi specifici diretti contro le proteine di interesse per comprendere e caratterizzare la loro espressione e cambiamenti cellulari nel tessuto specifico1,2,3. L’uso di immunohistochemistry è prevalente in ricerca in neuroscienza, tra le altre discipline scientifiche, aiutando nella comprensione del cervello4cellulare e molecolare. Studi su larga scala che coinvolge molti animali e sezioni del cervello possono essere sia risorse e tempo intensivo. Come tale, c’è un poliedrico razionale dietro lo sviluppo della Megabrain: per ridurre il tempo trascorso cryosectioning, montaggio e la macchiatura del tessuto, durante l’utilizzo di conseguenza meno reattivi. Inoltre, la possibilità di semplificare il processo e macchia più cervelli nello stesso turno aiuta ad alleviare alcuni della variabilità tra lotti, una limitazione di immunohistochemistry3di colorazione. Inoltre, un Megabrain di sezionamento è un’alternativa di risparmio di tempo ai singoli cervelli congelati del roditore di sezionamento e permette per un rapido confronto del tessuto tra animali o anche i gruppi di trattamento mediante tecniche di microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante questa procedura dovrebbe essere considerato che la temperatura della Megabrain e i suoi dintorni deve essere costantemente monitorata per evitare lo scongelamento e il ri-congelamento del tessuto. Il cervello può essere rimosso solo dal congelatore a-20 ° C fino a 3 volte come ogni volta che viene toccata e sinistra nel criostato, con una temperatura più calda fluttuante, il tessuto si scongela e si ricongela, causando una gelatina come consistenza e l’integrità di tessuto anormale10….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fondi di sostegno di missione PCH supportato la ricerca riferita in questo manoscritto. Gli autori vorrei ringraziare Daniel Griffiths per scattare le immagini utilizzate nelle figure.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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