Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Spermatogenesi mammifera sono considerato un processo altamente strutturato che comprende degli spermatogoni auto-rinnovamento e differenziazione attraverso spermatociti in spermatozoi aploidi tramite mitosi e meiosi spermiogenesi, durante il quale drammatica si verificano cambiamenti biochimici e morfologici. Cellule germinali in via di sviluppo sono progressivamente trasportate dalla base del tubulo seminifero verso il lume. Questo processo è regolato da contatti cellula-cellula fra le cellule germinali e le cellule Sertoli^1,2. Cellule di Sertoli adiacenti formano il BTB che si trova vicino alla base del tubulo seminifero. La BTB divide fisicamente l’epitelio in un basale e un vano di adluminal. Durante fasi VIII – IX del ciclo epiteliale, preleptotene/leptotene spermatociti dai comparti basali migrano attraverso il BTB, entrando il adluminal scomparti³. Di conseguenza, la funzione del BTB è di fornire un microambiente di nuova per il completamento della meiosi e spermiogenesi^4,5,6. A differenza di altre barriere di sangue-tessuti (ad es., barriera emato – encefalica) che sono composti solo da giunzioni strette (TJs), il BTB è formata da quattro diverse giunzioni (TJs, specializzazioni ectoplasmatica, giunzioni di gap e basati su filamento intermedio desmosomi) tra Sertoli cells^1,7.

Molti studi hanno utilizzato topi geneticamente modificati, infezioni da virus e tossici ambientali per studiare i meccanismi di BTB integrità^7,8,9. La rottura di BTB induce la spermatogenesi alterata e infertilità o sterilità. Poiché la formazione di BTB e l’integrità sono stati confermati per essere influenzata dai contatti tra le cellule di Sertoli⁸, un modello in vitro basato su colture primarie di cellule di Sertoli isolate è stato usato per lo studio BTB. Tuttavia, questo modello non può simulare accuratamente BTB dynamics in vivo. Inoltre, nessun tale co-coltura delle cellule di germe con le cellule di Sertoli è stato stabilito come capace di riflettere tutti i relativi componenti strutturali e funzionali dei BTB^10,11.

In generale, in vivo BTB integrità saggi sono in genere basati su piccole molecole, come EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e coniugato FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la diffusione della biotina o inulina-FITC dal vano basale è bloccata dalla struttura BTB. Pertanto, siamo in grado di utilizzare questo metodo per valutare l’entità del danno BTB rispetto ai gruppi di controllo. Mentre BTB può essere compromessa con determinati tipi di stimoli, quali il trattamento con cadmio cloruro (CdCl₂)¹², BTB diventa accessibile a piccole molecole, che alla fine entrare nel compartimento di adluminal come indicatori.

Un’analisi iniziale di in vivo BTB integrità consiste nell’iniettare biotina o inulina-FITC nella vena giugulare, che comporta un intervento chirurgico ed è invasivo, complicato e richiede molto tempo. Inoltre, le sostanze di reporter diffondono attraverso tutto il corpo attraverso la circolazione, la concentrazione locale di biotina o inulina-FITC nei tubuli seminiferi è limitata. Inoltre, l’esposizione sistemica può indurre reazioni immuni. Qui, presentiamo un semplice ed efficace in vivo BTB integrità dosaggio consentendo ad iniezione diretta di una piccola aliquota di inulina-FITC nell’interstizio di un testicolo. Utilizzando il metodo di etichettatura fluorescente, il processo di colorazione è conveniente, come gli anticorpi secondari non sono necessari. Qui, il processo di tintura fluorescente entrando il testicolo è visualizzato.