Label-Free Imaging d’unique protéines sécrétée par les cellules vivant via iSCAT microscopie

ATTENTION : Veuillez lire toutes les fiches signalétiques (FS) avant d’utiliser tout produit chimique, observer toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent et porter l’équipement de protection individuelle (lunettes de protection laser, lunettes de protection, gants, sarraus) selon les besoins. 1. construire l’iSCAT Microscope16,18 Remarque : Le microscope iSCAT se compose généralement d’un programme d’installation mis à jour le microscope inversé. En bref, un laser se concentre sur le plan arrière focal d’un objectif à grande ouverture numérique (NA) et une lentille d’imagerie est utilisée pour concentrer la lumière arrière diffusée par la particule sur une puce de la caméra. En général, ce microscope à champ large peut être construit à partir de zéro ou basé sur un microscope inversé existant. Ce protocole porte sur les étapes essentielles pour réaliser l’installation, alors que des changements dans le matériel usagé sont possibles. On trouvera une description plus détaillée de l’Assemblée d’un microscope iSCAT dans le œuvre de Arroyo et al. 18. ATTENTION : Un microscope iSCAT implique une classe IIIB de la source de lumière laser classe IV. Une protection oculaire appropriée est nécessaire lors du montage et alignement de l’optique du statif. Au cours de l’Assemblée de microscope, assurez-vous que le chemin d’accès du faisceau laser reste droite et n’est pas dévié comme nouveaux composants optiques sont ajoutés. Mettre en place le chemin de l’illumination du microscope. En utilisant une table optique amortie et un bloc de métal rigide, construire un microscope échantillon étape18 qui intègre un objectif de forte ouverture numérique (NA) (100 X / 1.46 NA) et une unité de traduction permettant la traduction échantillon latérales ainsi que changement d’orientation position de l’objectif.Remarque : Le fonctionnement d’un microscope iSCAT à la limite de détection de protéines simples est très sensible aux vibrations extérieures. Une étape de piezo centrosymétriques qui prend en charge l’échantillon de tous les côtés est recommandée pour limiter les excitations acoustiques de l’échantillon qui serait compromettre la stabilité latérale et focale. La figure 1 illustre une scène échantillon approprié, y compris l’unité de traduction piezo et l’objectif. En outre, il est recommandé que les montures massives et stables sont utilisés pour tous les composants optiques discutés dans les étapes suivantes. Ces composants sont facilement disponibles auprès de fournisseurs de l’optique commerciale. Utiliser une lentille de singulet de focale de 50 cm (objectif grand-angulaire) et à 45° (vertical) couplage des miroirs pour concentrer la lumière d’un laser diode à longueur d’onde 445 nm sur le plan arrière focal de l’objectif. Cela crée un faisceau collimaté au foyer avant de l’objectif et va devenir la source d’illumination iSCAT. Si nécessaire, filtrer le laser dans l’espace avant l’objectif de 50 cm par 30 µm sténopé ou monomode. Appliquer une goutte d’huile à immersion à l’objectif et placer une lamelle de verre dans le plan de l’échantillon de la platine du microscope. Cela se traduira par une poutre qui reflète vers le bas à travers l’objectif d’imagerie.Remarque : La réflexion découle de l’interface air-verre sur la surface supérieure de la lamelle d’échantillon et servira de base pour le faisceau de référence iSCAT. La saleté résiduelle ou la poussière sur la surface de la lamelle donnera lieu à la diffusion des sources ponctuelles, qui l’aide dans la mise au point correcte de l’objectif d’imagerie dans les prochaines étapes.ATTENTION : La majorité de la lumière laser transmet par l’intermédiaire de la lamelle couvre-objet et se déplace vers le haut de l’objectif. Placez un diffuseur spéculaire opaque (e.g., une carte de papier) au-dessus de la lamelle couvre-objet pour minimiser le risque de blessures causées par la lumière laser. Figure 1 : scène d’échantillon iSCAT. La photographie montre le bloc d’aluminium massif sur lequel l’unité de traduction piezo (noir) est montée ainsi que les 100 centré x objectif. L’étape 3-axe piézo-électrique permet un positionnement précis de l’échantillon dans le plan focal de l’objectif. Grosse mise au point est effectuée en tournant un tube fileté sur laquelle l’objectif est monté (non représenté). Le bloc est placé sur la table optique avec quatre caissons en acier au-dessus du miroir de couplage de 45°. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Configurer le chemin d’accès d’imagerie du microscope. Introduire un antireflet (AR)-enduit de séparateur de faisceau (réflexion de 70 %, 30 % de transmission) à un angle de 45° par rapport au faisceau incident et environ 10 cm après l’objectif grand-angulaire. Point le revêtement AR vers la source de laser. Cela transmet le faisceau incident et reflète la référence et dispersés de poutres à un angle de 90° vers le faisceau incident.NOTE : Séparateurs de faisceau de revêtement antireflet ou coincé sont recommandés comme des effets significatifs d’images fantômes et la frange peuvent se produire lorsque vous utilisez le faisceau fendage de cubes ou séparateurs de faisceau plane non couché. Voir la Discussion pour plus de détails. Si vous le souhaitez, n’importe quel faisceau réfléchi indésirable découlant de la partie arrière de la séparateur de faisceau peut être bloquée par l’utilisation d’un diaphragme à iris. Un séparateur de faisceau épais présentera un déplacement important faisceau de sorte que le laser ne peut pas entrer dans l’objectif directement plus. Si nécessaire, réaligner la marche des rayons laser avant le séparateur de faisceau pour assurer la bonne propagation à travers l’objectif.Remarque : Le séparateur de faisceau pourrait aussi figurer devant l’objectif de champ large et la platine du microscope est positionnée (à l’étape 1.1.2.), afin que le faisceau ne sera pas déplacé plus tard. À ce stade, le bras d’imagerie de l’interféromètre de l’accent et s’assurer que le plan de l’échantillon et la caméra sont parfocale. Placez un concave f = lentille-45 cm à la mesure 5 cm après l’objectif grand-angulaire dans le chemin du faisceau incident. Cela se traduira par un faisceau collimaté entrant dans l’ouverture arrière de l’objectif. Avec un écran placé dans le bras réfléchi de l’interféromètre, placer l’objectif dans le sens vertical pour trouver la position focale grosse. L’objectif est mise au point lorsque le faisceau frappe l’écran est collimaté.Remarque : La Figure 2 montre un schéma de ce processus. Enlever le deux f = lentille-45 cm et l’écran lorsque la mise au point grossière est terminée.Remarque : Au lieu d’utiliser une lentille de distance focale négative, l’objectif grand-angulaire lui-même peut être placé sur un support mobile et déplacé hors de la trajectoire du faisceau pour cette étape. Toutefois, pour parvenir à la configuration de microscope plus stable, il est recommandé de tenir l’objectif grand-angulaire dans une position fixe. Ajouter un deuxième f = 50 cm singulet lentilles pour concentrer la lumière dispersée et à collimater la lumière reflétée sur le capteur d’une caméra CMOS. Veiller à ce que la lentille est placée à 50 cm du plan arrière focal de l’objectif afin de re-collimater le faisceau de référence et de concentrer la lumière diffusée. Place le CMOS chip 50 cm de distance de la f = lentille 50 cm et de positionner le faisceau directement sur le milieu de la puce.Remarque : Les paramètres suivants sont généralement utilisés pour l’imagerie. La puissance du laser (longueur d’onde 445 nm) est définie sur 100 mW. Sténopé et faisceau répartiteur atténue la lumière transmise, afin que la puissance apparente en entrant dans l’objectif est d’environ 9 mW. Le diamètre du faisceau à la position de l’échantillon s’élève à 6 µm. Avec l’objectif d’imagerie utilisé, le grossissement efficace du système est d’environ 300 x. La taille de l’image sur la puce CMOS a la valeur 128 × 128 pixels dans la zone éclairée, résultant en un champ de vision d’environ 5 × 5 µm2. La figure 3 montre un schéma du microscope iSCAT entièrement assemblé. Figure 2 : grossière mise au point du microscope iSCAT. Le schéma montre l’arrangement des éléments optiques pour aider à mettre le système au point. Revêtement antireflet de la face arrière du séparateur de faisceau (70/30 BS) est marquée en rouge. Les distances importantes sont fournies en vert. La longueur focale (f) des lentilles utilisées sont indiquée. Composants dans la boîte bleue en pointillés sont ajoutés en étapes 1.2.6 – 1.2.7. La lentille concave (utilisé pour re-collimater le faisceau iSCAT convergents) et l’écran sont enlevées plus tard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : microscope iSCAT. Le schéma montre le microscope iSCAT complètement assemblé. Revêtement antireflet de la face arrière du séparateur de faisceau (70/30 BS) est marquée en rouge. Les distances importantes sont fournies en vert. La longueur focale (f) des lentilles utilisées sont indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Mettre en place des canaux supplémentaires d’imagerie.Remarque : Cette section ajoute un autre chemin d’imagerie pour le microscope qui permet l’observation d’une vaste zone entourant le laser iSCAT via au microscope à fond clair et pour contrôler la viabilité des cellules par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence. La sortie d’une source lumineuse de LED (environ 500 nm < λ < 580 nm) dans un long travail objectif NA distance 20 X / 0.4 et installer des composants mécaniques au-dessus de la chambre de mesure permettant la mise au point et de positionnement latéral de la sortie de LED sur le échantillon. Assurez-vous que la LED sortie de spectre couvre la gamme de l’excitation du marqueur de mort cellulaire (iodure de propidium (PI)) et n’interfère pas avec la fluorescence (λ > 600 nm). Si nécessaire, utilisez les filtres optiques. Se déplacer latéralement l’objectif supérieur afin que l’empeigne (grand champ) et inférieur (iSCAT) objectifs sont colinéaires. Ceci est déterminé en plaçant un écran sous l’objectif inférieur et en maximisant l’intensité de la lumière LED transmise sur l’écran. Placer un λ = 550 nm court passage miroir dichroïque (SPDM) de scinder la LED de transmise lumineuse de la voie de laser iSCAT. Diviser ce faisceau en deux canaux avec un séparateur de faisceau transmissif de reflective/92% de 8 % (BS). Le chemin d’accès de 92 % est le canal de fluorescence et le chemin de 8 % est utilisé pour l’imagerie champ lumineux. Image du canal lumineux-zone sur une caméra CMOS avec une f = objectif doublet achromatique de 5 cm. L’image de la chaîne de fluorescence sur une caméra CMOS distincte à l’aide d’un f = objectif doublet achromatique de 5 cm et un λ = 600 nm long-pass filter pour bloquer la lumière d’excitation. Figure 4 a montre une représentation schématique du microscope entièrement assemblé, y compris toutes les voies d’imagerie. Figure 4 : iSCAT microscopie des protéines sécrétées par les cellules individuelles. (a) schéma du microscope décrit dans le protocole. Voir section 1 pour plus d’informations. Abréviations : LED, diodes électroluminescentes ; SPF, court-filtre ; obj, objectif ; SPDM, miroir dichroïque de passes courtes ; BS, séparateur de faisceau ; LPF, filtre passe-longue ; BF, lumineux-zone ; fluor, fluorescence ; C1-C3, caméra 1-3. (b) Bright-champ image d’un seul Laz388 de cellules environ 4 µm loin du champ de vision d’iSCAT (représenté par un carré blanc). Image prise par la caméra C3, barre d’échelle : 10 µm. (c) Fluorescence image de la même région (b) montre la position de la cellule marquée par un cercle blanc. L’absence de fluorescence indique que la cellule n’est viable. Image prise par la caméra C2, barre d’échelle : 10 µm. (d) Raw iSCAT caméra image capture instantanée avec temps d’exposition de 80 µs. Image prise par la caméra C1. image d’iSCAT (e) de la même région après soustraction de contexte spatio-temporel comme décrit dans la section « discussion ». L’image a été intégré sur 1000 séquentielle trames brutes (d) avec un temps de l’image finale de 400 ms et révèle la rugosité de la lamelle de verre. (f) correspondant iSCAT différentielle image qui affiche l’événement de liaison de 2 protéines sur la lamelle couvre-objet. L’image a été construite en soustrayant deux images consécutives de filtré (e). Échelle des barres (d), (e) et (f) : 1 µm. Ce chiffre a été adapté de McDonald, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Configurer l’ordinateur et le logiciel. Connecter tous les appareils photo à un ordinateur. Installer les packages de pilotes respectifs et obtenir/écriture logiciel pour leur contrôle.Remarque : Un matériel adapté est nécessaire pour les acquisitions à grande vitesse. Au minimum, un processeur multi-core, 16 Go de RAM, une carte de grabber de châssis et un disque SSD pour le stockage de données sont recommandés. Surveiller l’image iSCAT la caméra CMOS et veiller à ce que c’est au point de trouver une particule de poussière ou de saleté résiduelle sur la lamelle de verre. Vérifiez que l’image de la particule est qu’un point circulairement symétrique fonction (PSF) d’étalement.NOTE : La raison principale pour un PSF circulairement non symétrique est que le faisceau laser n’entre pas dans l’objectif, tout droit, mais à un petit angle par rapport à l’axe optique. C’est corrigé en ajustant l’angle et la position du faisceau incident avec le miroir de couplage de 45°. Comparez les images de la caméra du vif-champ et les canaux de fluorescence. Veiller à ce que les deux sont en discussion et affichent la même zone. Vérifier que la position du laser iSCAT est environ dans le centre de l’image et prendre note de sa position pour référence ultérieure. Voir Figure 4 b – 4f pour des images de caméra typique.Remarque : Utilisez un échantillon cellulaire ou perles fluorescentes pour trouver l’accent des deux canaux. Retirer temporairement le filtre long-col de fluorescence pour régler le système. La mise au point pour l’imagerie conventionnelle des cellules doit être légèrement supérieure à celle du plan focal iSCAT. Pour compenser cela sans bouger l’objectif, déplacer les caméras postées dans le foyer de la f respectifs deux = lentilles de 5 cm. Définissez les paramètres de caméra nécessaires. Utiliser une fréquence d’images fixes et désactiver les outils gain et correction des logiciels.Remarque : Les paramètres suivants sont utilisés : la caméra iSCAT est définie sur 5000 images par seconde (fps) avec un temps d’exposition de 80 µs. Comme mentionné ci-dessus, la taille de l’image est de 128 × 128 pixels. Caméras de fluorescence et lumineux-terrain exploité à taille d’image complète (1280 × 1024 pixels). Bright-champ imagerie est réalisée avec un temps de pose de 20 ms. La caméra à fluorescence est définie pour la durée d’exposition de 750 ms et 5 images consécutives sont accumulent pour former une image finale. Bright-champ et la fluorescence des images sont acquises à intervalles de temps s 20 fixes. 2. préparation de l’expérience Préparer le milieu de la microscopie stock. Ajouter 25 mL de Solution tampon HEPES (1 mol/L) à 975 mL du milieu RPMI 1640 pour obtenir une finale 1 L de solution HEPES 25 mmol/L. Sinon, utilisez un milieu tampon HEPES déjà inclus.NOTE : HEPES est utilisé pour maintenir la valeur du pH du milieu pendant une mesure en conditions ambiantes (p. ex., en dehors d’un incubateur et sans l’apport constant de2 CO). Prélever une partie aliquote de la solution nécessaire pour une expérience et laissez-le chauffer jusqu’à la température ambiante. 2 mL de milieu est suffisante. Garder le reste de la solution stock à 4 ° C. Préparer la cupule de microscope.Remarque : Les étapes suivantes décrivent la procédure pour un porte-échantillon sur mesure consistant en une plaque de base en aluminium et un plat de cuve acrylique qui corrige la lamelle couvre-objet et il les couples sur le positionneur 3D piézoélectrique. Disponible dans le commerce de Pétri stérile avec un fond de verre peut également être utilisé.NOTE : La Figure 5 illustre de photographies du porte-échantillon sur mesure. Prenez une nouvelle lamelle de microscope et rincer à l’eau désionisée (DI-eau) et d’éthanol. Sécher à l’air la diapositive avec azote ou air comprimé. Nettoyer la lamelle dans une atmosphère de plasma d’oxygène (pression de gaz de 0,3 mbar) pendant 10 min à 500 W RF power. Cela supprime toutes les impuretés organiques de la surface. Nettoyer le plat de la cuve acrylique en l’immergeant dans 0,2 mol/L de solution de NaOH pendant environ 10 min. rincer avec l’eau distillée. Assembler le porte-échantillon et couvrir avec un plastique de Petri stérile jusqu’à ce que nécessaire dans l’expérience. Figure 5 : porte-échantillon Custom-Built. (a) échantillon de composants du titulaire : (1) plat de cuve acrylique ; (2) plaque de base en aluminium ; (3) vis de maintien ; (4) silicone joint torique ; (5) couvre-objet. (b) sans démontage porte-échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Préparer le microscope. Allumer le laser d’illumination iSCAT, l’éclairement lumineux-champ/fluorescence LED, appareils photo et l’ordinateur/logiciel d’acquisition. Bloquer le faisceau laser vers une position devant l’objectif. Veiller à ce que le 100 X / 1.46 objectif NA est propre. Si ce n’est pas le cas, utiliser de l’éthanol et lingettes de nettoyage pour lentilles pour nettoyer l’objectif conformément aux instructions du fabricant. Appliquez une goutte d’huile à immersion sur l’objectif de microscope. Prendre le porte-échantillon (assemblé à la section 2.2) et le monter avec soin sur la scène de piezo du microscope iSCAT afin que la lamelle d’échantillon est centrée sur l’objectif de microscope. Être attentif et prudent éviter d’endommager la lentille de l’objectif. Fixer l’appareil sur le positionneur piézoélectrique avec les vis de pouce tout en s’assurant que le constructeur spécifié couple maximal n’est pas dépassé. Ajouter 1 mL de milieu de microscopie stock (préparée à la section 2.1.) dans la cupule. Ajouter 2 gouttes de l’iodure de propidium au milieu comme une cellule mort marqueur16,22. Débloquer le laser et mettre le système au point. Tout d’abord, vérifiez que l’objectif soit positionné à la bonne distance de la lamelle couvre-objet en répétant les étapes 1.2.3. – 1.2.5. (Figure 2). Puis, affiner la mise au point avec l’axe z de la scène de piezo. Confirmez que tous les paramètres pour les sources lumineuses, des caméras et logiciels sont correctement définies. Cela inclut les paramètres tels que la puissance du laser, LED intensité, taux de trame de caméra, temps d’exposition de caméra ou logiciel enregistrer les chemins d’accès.Remarque : Enregistrer des vidéos au taux de rafraîchissement élevé peut produire des tailles de fichier volumineux. S’assurer que suffisamment d’espace libre sur le disque sur l’ordinateur. Bloquer à nouveau le faisceau laser. Le microscope est maintenant prêt pour une expérience. Préparer les cellules.Remarque : Laz388 cellules20 sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum de veau foetal (FCS), acides aminés, le pyruvate et antibiotiques. Les cellules sont incubées à 37 ° C et 5 % de CO2 diviser et sont fournis avec un milieu frais chaque 2 ou 3 jours à23. Prenez le flacon de culture cellulaire de l’incubateur et aspirer le milieu contenant environ 1 x 106 cellules. Pour déterminer le volume correct, quantifier la concentration de la culture cellulaire par l’utilisation d’un hémocytomètre. Mélanger la solution de la cellule avec 10 mL de milieu RPMI 1640 à température ambiante et centrifuger l’échantillon à 300 g pendant 7 min. Soigneusement extrait et éliminer le liquide surnageant tout en veillant à ce que le culot de cellules concentrées reste inchangée. Répétez les étapes 2.4.2. – 2.4.3. avec la pastille concentrée de cellules. Remettre en suspension les cellules dans 0,5 mL de milieu de microscopie stock (préparée à la section 2.1.) et de les utiliser immédiatement dans une expérience. 3. iSCAT microscopie des cellules sécrétrices Veiller à ce que le faisceau laser est bloqué pour empêcher les cellules d’être directement exposés à la lumière de laser iSCAT. Injecter les cellules dans la cupule de l’échantillon. Injecter environ 3 µL de l’échantillon de cellules (préparés au point 2.4.) légèrement décentré dans la cupule de l’échantillon. Toucher doucement l’embout de la pipette à la lamelle et injecter lentement la solution de la cellule. Laissez les cellules à s’installer sur la lamelle couvre-objet.Remarque : Utiliser des pointes de pipette de petit volume (10 µL) ou conseils de gel-chargement longs et flexibles. Veiller à ce que la densité des cellules est inférieure à environ 1 cellule par 500 µm² afin que les mesures unicellulaires ne sont pas influencés par plusieurs cellules dans la zone qui entoure le laser iSCAT. Si le nombre de cellules est trop faible, répéter étape 3.2.1. jusqu’à ce qu’un nombre suffisant soit disponible. Si la couverture des cellules est trop dense, utiliser une injection d’environ 20 µL de milieu de microscopie supplémentaires pour disperser les cellules dans l’ensemble de la lamelle. En utilisant le positionneur piezo, déplacez l’échantillon latéralement sur la position d’une cellule proche (environ 10 µm) pour le champ de vision d’iSCAT. Veiller à ce que la cellule n’entre pas dans le champ de vision d’iSCAT comme une exposition directe à la lumière de laser 445 nm peut être nocive pour la cellule. Images lumineuses-champ et fluorescence permet de localiser et vérifier la viabilité de la cellule25.Remarque : Une cellule viable a une forme ronde à l’image du champ lumineux et n’est pas fluorescente, alors que la mort cellulaire est indiquée par des signaux de forte fluorescence découlant de la présence de l’iodure de propidium à l’intérieur de la cellule22. Débloquer le laser iSCAT et veiller à ce que la surface de la lamelle couvre-objet est toujours au point. Joindre la table isolation pour réduire la dérive et couplage acoustique de l’environnement ambiant.NOTE : Ce dernier est réalisé avec lourds rideaux optique ou de panneaux en acrylique qui entourent la table optique. Démarrer la mesure par l’acquisition des images des caméras iSCAT, lumineux-zone et fluorescence. Automatiser et de contrôler le processus grâce à des logiciels pour maximiser l’efficacité expérimentale. Vérifier périodiquement la viabilité de la cellule et la mise au point du système.Remarque : Selon l’intensité du laser, composants optiques et réglages de temps d’exposition de la caméra, le laser iSCAT risquent d’interférer avec la caméra à fluorescence. Si ce comportement est observé, envisager de coffrage le laser iSCAT temporairement au cours de l’acquisition d’image de fluorescence. 4. analyse des données Remarque : Les données expérimentales sont intrinsèquement bruyantes et iSCAT images ne sont pas différents. Il existe plusieurs sources de bruit dans une mesure iSCAT typique, y compris distorsions de front d’onde dans la source de lumière incidente, la rugosité de la surface de la lamelle couvre-objet et le bruit de l’appareil photo. La section ci-dessous présente quelques façons dont ces sources de bruit sont corrigées par l’intermédiaire de post-traitement. En outre, latérales instabilités mécaniques de l’installation entraîner données bruitées et doivent être abordées en conséquence, tel que décrit dans la section discussion ci-dessous. Les analyses décrites sont réalisées avec des scripts MATLAB personnalisés. Minimiser le bruit de l’appareil photo en filtrant les données brutes d’un filtre de Fourier bidimensionnel qui exclut les hautes fréquences spatiales. La taille du filtre doit être ajustée pour s’adapter à la configuration expérimentale spécifique (principalement déterminée par l’ouverture numérique du système).Remarque : Les caractéristiques dans l’image avec des fréquences spatiales plus élevées que le système optique proviennent de sources externes (tels que le bruit de lecture de caméra) et peuvent être négligés. Convertir les images de caméra raw comtes iSCAT contraste.NOTE : Le signal détecté par la caméra est . iSCAT contraste est défini comme où est l’intensité de la lumière de la référence, dans ce cas la partie reflétée par la lamelle, et est l’interférence entre et l’intensité diffusée (). Séparer le signal en et en calculant la moyenne temporelle des cadres spécifique dans lequel les particules d’intérêt ne sont pas présents. L’image résultante donne le signal de référence .Remarque : Vous pouvez également une étape de soustraction de fond peut-être être effectuée comme indiqué dans l’exposé qui suit. Calculer le contraste selon 12,14,16. Créer une image différentielle roulement en soustrayant chaque image consécutive de son successeur.NOTE : Résiduelle des signaux de la rugosité de la lamelle et wavefront distorsions sont efficacement supprimées dans cette étape car ils sont constants dans les images consécutives. Le différentiel de roulement supprime ces signaux résiduelle, laissant uniquement les liaisons protéiques qui se produisent d’une image à l’autre. Cette soustraction de fond dynamique est bénéfique car il n’est pas sensible aux dérives d’échantillon à long terme. Appliquer un algorithme de recherche de pointe pour détecter et les particules unique pour chaque image, déterminer leur contraste spécifique et leur position. Utiliser l’information recueillie à l’étape 4.4 pour créer des histogrammes des événements de liaison de protéine et concernent leurs contrastes extraites de la masse des protéines dans une courbe d’étalonnage compilée à partir de14,échantillons protéiques connus24.