Summary

급성 척수 조각 Substantia Gelatinosa 신경에 있는 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 준비

Published: January 18, 2019
doi:

Summary

여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.

Abstract

신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.

Introduction

Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템1에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 3 , 4 뿐만 아니라 SG5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능9,10, 채널 및 시 냅 스 활동11,12 다양 한 병 적인 조건 하에서. 이러한 연구 개발에 재생 SG 신경 역할에 대 한 우리의 이해 및 만성 통증과 neuropathic 가려움증의 유지 보수 깊 어 있다.

기본적으로, 이상적인 전체 셀 패치 급성 척수 조각을 사용 하 여 신경 소마의 명확한 시각화를 달성 하기 위해 핵심 필수 건강 하 고 패치되지 뉴런 얻어질 수 있다 조각의 우수한 품질을 보장 하기 위해입니다. 그러나, 척수 조각 준비 복 부 laminectomy 수행 하 고 건강 한 조각을 얻기에 장애물이 될 수 피아-거미 집 모양의 막 제거 등의 여러 단계가 포함 됩니다. 그것은 척수 조각 준비 하기 쉬운, 척수 조각에 녹음에서 시험관에서 수행는 여러 가지 장점이 있습니다. 셀 문화 준비에 비해, 척수 조각 순수 관련 조건에는 고유한 시 냅 스 연결을 부분적으로 보존할 수 있습니다. 또한, 전체 셀 패치 클램프 척수 조각을 사용 하 여 녹음 더블 패치 클램프13,14, 형태학 연구15,16 단일 셀 RT-PCR 등의 다른 방법을 결합 될 수 있는 17. 따라서,이 특정 지역 내에서 해 부와 유전 다양성을 특성화에 더 많은 정보를 제공 합니다 기술과 지역 회로의 구성의 조사에 대 한 수 있습니다.

여기, 우리는 급성 척수 조각을 준비 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 SG 뉴런에서 인수에 대 한 우리의 방법의 기본과 상세한 설명을 제공 합니다.

Protocol

모든 실험 프로토콜 설명 동물 윤리 위원회의 남 창 대학 (난창, 홍보 중국, 윤리적인 No.2017-010)에 의해 승인 되었다. 모든 노력이 스트레스와 실험 동물의 고통을 최소화 하기 위해 만들어졌다. 여기 수행 electrophysiological 녹음 실 온 (RT, 22-25 ° C)에서 실행 되었다. 1입니다. 동물 어느 섹스의 Sprague-Dawley 쥐 (3-5 주 이전)을 사용 합니다. 12 h 빛 어두운 주기에서 동물을 집 고…

Representative Results

급성 척수 조각 그림 1에 표시 된 다이어그램에 따라 준비 되었다. 조각화 및 복구, 후 척수 조각 녹음 실로 옮겨 졌다. 건강 한 신경 소마 모양 IR DIC 현미경을 사용 하 여에 따라 확인 되었다. 다음, SG 뉴런의 활동 전위 전류 펄스 (1 s 기간) depolarizing의 시리즈에 의해 elicited 했다 신경 RMP에서 열렸다. 보이는 것 처럼 그림 2설명 되…

Discussion

이 프로토콜 세부 SG 뉴런18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런19에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (No. 81560198, 31660289)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

NaCl Sigma S7653 Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl Sigma 60130 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O Sigma 71500 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O Sigma C5080 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O Sigma M2670 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3 Sigma S5761 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose Sigma G7021 Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid Sigma P5280 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate Sigma A7631 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose Sigma S7903 Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate Wako 169-11835 Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine Sigma P1937 Used for the preparation of intracellular solution
EGTA Sigma E3889 Used for the preparation of intracellular solution
HEPES Sigma H4034 Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP Sigma A9187 Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP Sigma G5884 Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4 Sigma C1426 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl Sigma C3011 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl Sigma T2265 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488 Vector SP-1145 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar Sigma A7002 3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde Sigma P6148 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4 Hengxing Chemical Reagents Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium Polyscience 18606
Urethan National Institute for Food and Drug Control 30191228 1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments TW150F-4 1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller Sutter Instrument P-97 Used for the preparation of micropipettes
Vibratome Leica VT1000S
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corporation 63544
Infrared CCD camera Dage-MIT IR-1000
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285
X-Y stage Burleigh GIBRALTAR X-Y
Upright microscope Olympus BX51WI
Osmometer Advanced FISKE 210
PH meter Mettler Toledo FE20
Confocol microscope Zeiss LSM 700

References

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Zhu, M., Zhang, D., Peng, S., Liu, N., Wu, J., Kuang, H., Liu, T. Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons. J. Vis. Exp. (143), e58479, doi:10.3791/58479 (2019).

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