여기, 우리가 시험관에서 척수 조각에서 신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 만든 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수 단계 설명 합니다. 이 메서드는 기본 막 속성, 시 냅 스 전송 및 공부 SG 뉴런의 형태학 상 특성을 수 있습니다.
신경 세포 substantia gelatinosa (SG)에서 최근 전체 셀 패치 클램프 연구는 큰 신체의 감각 전송, nociceptive 규정과 만성 통증이 나 가려움 개발 기본 척추 메커니즘에 대 한 정보를 제공 합니다. 신경 속성에 대 한 우리의 이해 및 sg에서 지역 회로의 구성에 추가 형태학 연구 급성 척수 조각의 유틸리티에 따라 함께 electrophysiological 녹음의 구현 향상 되었습니다. 여기, 우리는 척수 조각 및 쇼 대표 전체 세포 기록 및 형태학 결과의 준비에 대 한 상세 하 고 실용적인 가이드를 제시. 이 프로토콜 이상적인 신경 보존을 허용 하 고 어느 정도 조건 vivo에서 모방 수 있습니다. 요약 하자면, 척수 조각의 생체 외에서 준비 얻을 수 안정 된 전류와 전압 클램프 녹음을 가능 하 게 수 따라서 용이 하 내장 막 속성, 로컬 회로에 대 한 자세한 조사와 다양 한 실험 방법을 사용 하 여 신경 구조입니다.
Substantia gelatinosa (SG, lamina 척추 등 경적의 II) 전송 하 고 규제 하는 감각 정보에 대 한 논의 여지가 없 중요 한 릴레이 센터 이다. 그것은 기본 구심 섬유, 지역 수 및 생 내림차순 억제 시스템1에서 입력을 받아 흥분 성의 억제 수 구성 됩니다. 최근 수십 년간, 급성 척수 조각 준비의 개발 및 전체 셀 패치 클램프 기록의 출현 설정한 SG 뉴런2, 의 본질적인 electrophysiological 및 형태학 속성에 대 한 다양 한 연구 3 , 4 뿐만 아니라 SG5,6에 로컬 회로의 연구. 또한, 생체 외에서 척수 조각 준비를 사용 하 여 연구원 신경 excitabilities7,8에 변화를 해석할 수 있는, 이온의 기능9,10, 채널 및 시 냅 스 활동11,12 다양 한 병 적인 조건 하에서. 이러한 연구 개발에 재생 SG 신경 역할에 대 한 우리의 이해 및 만성 통증과 neuropathic 가려움증의 유지 보수 깊 어 있다.
기본적으로, 이상적인 전체 셀 패치 급성 척수 조각을 사용 하 여 신경 소마의 명확한 시각화를 달성 하기 위해 핵심 필수 건강 하 고 패치되지 뉴런 얻어질 수 있다 조각의 우수한 품질을 보장 하기 위해입니다. 그러나, 척수 조각 준비 복 부 laminectomy 수행 하 고 건강 한 조각을 얻기에 장애물이 될 수 피아-거미 집 모양의 막 제거 등의 여러 단계가 포함 됩니다. 그것은 척수 조각 준비 하기 쉬운, 척수 조각에 녹음에서 시험관에서 수행는 여러 가지 장점이 있습니다. 셀 문화 준비에 비해, 척수 조각 순수 관련 조건에는 고유한 시 냅 스 연결을 부분적으로 보존할 수 있습니다. 또한, 전체 셀 패치 클램프 척수 조각을 사용 하 여 녹음 더블 패치 클램프13,14, 형태학 연구15,16 단일 셀 RT-PCR 등의 다른 방법을 결합 될 수 있는 17. 따라서,이 특정 지역 내에서 해 부와 유전 다양성을 특성화에 더 많은 정보를 제공 합니다 기술과 지역 회로의 구성의 조사에 대 한 수 있습니다.
여기, 우리는 급성 척수 조각을 준비 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 SG 뉴런에서 인수에 대 한 우리의 방법의 기본과 상세한 설명을 제공 합니다.
이 프로토콜 세부 SG 뉴런18,19,,2021에 전체 셀 패치 클램프 실험을 수행할 때 우리가 성공적으로 사용한 척수 조각 준비 단계. 이 메서드를 구현 하 여 우리는 최근 그 minocycline 보고 차세대 항생물질, 현저 하 게 SG 뉴런19에 연 접 메커니즘을 통해 억제 시 냅 스 전송 향상 시킬 수 있는….
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (No. 81560198, 31660289)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |