Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi
Summary
Burada PEG aracılı dönüşüm yöntemi kullanarak önceki proteinler ifade için bir protokol açıklayın. Kolay ifade ilgi protein ve protein yerelleştirme ve çeşitli deneysel koşullar için alma işlemini verimli soruşturma yöntemdir içinde vivo.
Abstract
Kloroplast bitkilerde fotosentez ve birçok sekonder metabolitler ve lipidler üretimi gibi çeşitli hücresel süreçler sorumlu bir önemli organel olduğunu. Kloroplast proteinler, çok sayıda bu çeşitli fizyolojik işlemlerini gerçekleştirmek için gerekir. Üzerinde kloroplast proteinlerin % 95’i sitozolik ribozomlara çeviri sonra çekirdek kodlanmış ve kloroplast sitozol üzerinden içine alınan. Böylece, uygun alma veya bu çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler kloroplast için hedefleme kloroplast yanı sıra bitki hücre düzgün çalışması için gereklidir. Çekirdeği kodlanmış kloroplast proteinler belirli kloroplast için hedefleme için sinyal sıraları içerir. Moleküler makine kloroplast veya sitozol lokalize bu sinyalleri tanımak ve alma işlemi taşımak. Protein alma veya kloroplast içinde vivoiçin hedefleme mekanizmaları araştırmak için Arabidopsis kloroplast protein içe aktarma işlemi çözümlemek için bir hızlı, verimli protoplast tabanlı yöntemi geliştirdi. Bu yöntemde, Arabidopsisyaprak dokulardan izole önceki kullanın. Burada, biz tarafından proteinler kloroplast alındığı mekanizması araştırmak için önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağlar.
Introduction
Kloroplast tesislerinde en önemli organelleri biridir. Kloroplast ana işlevleri fotosentez1taşımak için biridir. Kloroplast da yağ asitleri, amino asitler, nükleotit ve çok sayıda sekonder metabolitler1,2üretimi için birçok biyokimyasal reaksiyonlar yürütmek. Tüm bu tepkiler, proteinlerin farklı türleri, çok sayıda kloroplast gerektirir. Ancak, kloroplast genom sadece yaklaşık 100 gen3,4içerir. Bu nedenle, kloroplast onların proteinler çoğunluğu sitozol almanız gerekir. Aslında, çoğu kloroplast proteinler sitozol çeviri4,5,6sonra alınmak üzere gösterilmiştir. Bitki hücreleri proteinler sitozol kloroplast için almak için belirli mekanizmaları gerektirir. Her ne kadar son birkaç yıldır bu protein alma mekanizmaları araştırdık, ancak, biz hala tam olarak onları moleküler düzeyde anlamıyorum. Burada, biz önceki hazırlanması ve exogenously önceki genlerinde ifade için detaylı bir yöntem sağlar. Bu yöntem protein alma kloroplast ayrıntılı içine temel moleküler mekanizmaları elucidating için değerli olabilir.
Protein alma birçok farklı yaklaşımlar kullanarak okudu olabilir. Bu yöntemlerden birini vitro protein alma sistem7,8kullanımını gerektirir. Bu yaklaşım, vitro-çevrilmiş protein öncüleri arıtılmış kloroplast vitroile inkübe ve protein alma tarafından SDS-sayfası western blot Analizi tarafından takip analiz edilebilir. Bu yaklaşımın avantajı olduğunu protein alma her adım kloroplast içine ayrıntılı olarak incelenecektir. Bu nedenle, bu yöntem yaygın protein alma moleküler makine bileşenleri tanımlamak için ve sırası bilgi için transit peptidler incelemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, başka bir yaklaşım önceki yaprak dokuları üzerinden kullanımını içeren geliştirilmiş ve yaygın olarak protein alma kloroplast9,10içine eğitim için kullanılır hale. Bu yaklaşımın avantajı önceki vitro sistemi daha sağlam hücreleri olan yakın bir hücresel ortamı sağlamaktır. Böylece, protoplast sistem bize bu işlem, ilişkili sitozolik olaylar ve sinyalleri hedefleme özgüllüğü belirleme gibi birçok ek yönlerini ele sağlar. Burada, protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya önceki kullanımı için detaylı bir protokol mevcut.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz protein ithal etmek içine kloroplast çalışmaya Arabidopsis önceki kullanımı için detaylı bir protokol sağladı. Bu protein alma işlemi soruşturma için güçlü bir yöntemdir. Bu basit, çok yönlü teknik kloroplast için amaçlanan kargo proteinlerin hedefleme incelenmesi için yararlıdır. Bu yöntemi kullanarak, önceki yaprak dokuları tam olgun yaprakları çok erken arasında değişen birçok farklı büyüme aşamalarında bitkilerden elde Arabidopsis11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kooperatif araştırma programı destekler ile tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No için yapılmıştır PJ010953012018), Kırsal Kalkınma İdaresi ve ICT (No. 2016R1E1A1A02922014) ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı (Kore) hibe Kore.
Materials
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C. Protein Transport into Chloroplasts. Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
