זיהוי של 3-Nitrotyrosine סביבות אטמוספרי דרך ביצועים גבוהים מערכת גלאי אלקטרוכימי-כרומטוגרפיה נוזלית
Summary
אנו מציגים שיטה כדי לזהות שינויים כימיים 3-nitrotyrosine של חלבונים אטמוספרי עם 6 מ מ קוטר סבבים של אוויר סמפלר prefilters באמצעות ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-אלקטרוכימיות גלאי (HPLC-ECD).
Abstract
3-nitrotyrosine (3-NT) מופק השאריות טירוזין ב אטמוספרי ביו-תרסיס חלבונים באמצעות תגובה עם האוזון (O3), חנקן דו-חמצני (2). 3 יציב-NT סמן ספציפי עבור נזק חמצוני, דווח כי אפקט promotive לעורר אלרגיה. במחקר הנוכחי, מדווחים על התפתחות assay רגישה מאוד לכמת 3-NT ב מסנני אוויר סמפלר לאסוף < 2.5 מיקרומטר של חלקיקים (PM2.5) מהאוויר סביבתי עירוני, כולל ביו-תרסיס. בשיטה זו, 6 מ מקוטר חור עגול נחתך מן המסננים של אוויר דוגמי ולאחר מעורבב עם קוקטייל פרוטאז לא ספציפית על מנת hydrolyze חלבונים. דגימות חלבון מתעכל אל רמת חומצת אמינו נבדקו עבור 3-NT באמצעות ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה-אלקטרוכימיות גלאי (HPLC-ECD). התוכן 3-NT המרבי זוהה עם prefilter עבור PM הגדלים בין 4.5 ל 7.3 μm, עם מגבלה בזיהוי של pg/m 1.133.
Introduction
תרסיס או PM באוויר מכיל חלבונים ממקורות ביולוגיים שונים, לרבות וירוסים, אאוקריוטים, פטריות, צמחים (אבקה) בעלי חיים (חרקים, האדם)1. היחס של תכולת החלבון ב- PM מוערך כמעט 5%, אשר היה מעורב לשחק תפקיד מרכזי אלרגנים באוויר2. דיווחים אחרונים מראים את תרסיס אמביינט עירוניים שונים הגדלים מכילים חומצות אמינו עם יחס הנע בין 0.5% ל-2%3. בנוסף, שינויים כימיים של חלבונים PM שהוצעו כדי ליצור את התגובות של חלבונים עם מזהמים שונים,3O, חנקן דו-חמצני (2) ו גופרית דו-חמצנית (SO2)4.
3-NT – שינוי חלבון – נוצר על ידי ניטרציה של שאריות טירוזין. ריכוז גבוה יותר של O3 ו-2 הוכח כדי לקדם את ניטרציה של מולקולות חלבון מדומים אטמוספרי שטח5,6. ניטרציה של טירוזין שאריות פוליפפטיד מגביר את פוטנציאל אלרגני של אבקה חלבונים7. לכן, כימות והערכה של 3 מוטס-NT הוא היבט חשוב בהתייחסות את החששות של בריאות וסביבה.
3-NT הידוע גם סמן של חמצון, nitrosative להדגיש8. גוף המתעוררים של ראיות הראו קשר משמעותי של תוכן 3-NT עם מחלות האדם מספר9,10. בשל השפעות מזיקות שלה, זיהוי, הערכה כמותית של 3-NT דגימה ביולוגית החזק רלבנטיות גדולה בקביעת מצב בריאותו של הפרט. בשנים האחרונות הוכנסו שיטות מגוונות כדי להעריך את התוכן 3-NT, כולל מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent, HPLC, LC/MS11. במחקרים קודמים, אנו מדווחים על שיטת זיהוי בטכניקה HPLC-ECD וחטאיו עם מספר יתרונות לעומת שיטות קודמות. לדוגמה, HPLC-ECD אינו דורש הליך חילוץ או derivatization, מה שהופך אותו עם מערכת פשוטה יחסית assay12. יש לנו אישר כי שיטה זו ישימה לזהות 3-NT של דגימות ביולוגיות (פלזמה מן האדם, עכברוש).
למרות חקירות רבות הדגישו את הגילוי של 3-NT בדגימות ביולוגיות, זיהוי שלו בדגימות nonbiological עודנו, ומכאן יש כנראה תפס את המחקר הנוכחי. למעשה, כדי להעריך את ההשפעה המזיקה של מוטס 3-NT, שיטה כמותית זה שימושי לזהות 3-NT ישירות מחלקיקים באוויר נדרש; לכן, והגשנו בקשה השיטה HPLC-ECD הקיימת לזהות 3-NT של PM2.5 שנאסף על מסנן סיבי זכוכית. באמצעות הטכניקה, 3-NT יכול להתגלות ישירות מתוך קטן חתיכות (חורים עגולים 6 מ מ קוטר) של המדגם של מסנן אוסף PM. אנו עוד יותר להעריך את התוכן של 3-NT במגוון גדלים PM, מדדו את מגבלת זיהוי של 3-NT. המאמר הנוכחי מציעה שיטה גבוהה רגיש תפוקה גבוהה כדי לזהות 3-NT ישירות מתוך דוגמאות הן nonbiological והן ביולוגי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה כימות להערכה 3-NT PM מוטס שנאסף על מסננים קוורץ בשיטות HPLC-ECD רגישה מאוד.
באופן כללי, פותחו שיטות מדידה 3-NT כמו סמנים ביולוגיים של סטרס חמצוני של מחלות אנושיות. נוגדן מבוססי שיטות (למשל, וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent) נחשבים כמו חצי כמותית כי יש ללא אימות assay קפדנית שקשה להעריך את מהימנות המבחן. HPLC עם איתור אלקטרוכימי (ECD) מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה יש רגישות מספקת עבור כימות של 3-NT13. למרות שהם רגישים, שיטות מבוססות ספקטרומטר מסה כמו GC-MS או GC-MS/MS לדרוש את derivatization של חומצות אמינו, התהליך של derivatization לעיתים קרובות גורמת להיווצרות של חפצים14.
לעומת טכניקות GC והן LC, HPLC-ECD יקר יחסית פחות ויש לו רגישות מספקת מידה 3-NT. בנוסף, הצעד derivatization GC-MS ו- LC-MS לעתים דרוש זמן נוסף. למרות השיטה המובאת כאן דורש 16 שעות עבור השלב עיכול חלבון, זה יכול, בכל זאת, יבוצע לילה (כפי שתואר לעיל, בערך 30 דקות של זמן על הידיים נדרשת עבור דגימה). מדידה חוזרת אוטומטית על-ידי שימוש של תעשיה עשוי לספק מערכת מדידה תפוקה גבוהה. מחקרים קודמים דיווחו אימונולוגי שיטות למדוד 3-NT ב PM2,7; עם זאת, שיטות כאלה לא היתה אפשרות לזהות 3-NT בעונת החורף בשל רמות נמוכות של 3-NT PM15.
השיטה HPLC-ECD יש יתרונות נוספים על פני אחרים בשיטות הרגילות; לדוגמה, (i) תהליך החילוץ לא נדרש בשיטה זו, (ii) זה לגמרי ללא דטרגנט, (iii) יש דרישה מדגם מינימלי, וזה, חשוב, (iv) רגישות גבוהה. חלקיקים שנאספו על גבי המסננים מופרדות לעתים קרובות sonication לחקירה נוספת, לרבות כימות של הרכיבים השונים. חומרי ניקוי משמשים גם כדי לבודד חלבונים PM-מחויב ממסנני. עם זאת, אלה צעדים נוספים להגביר את הסיכון של זיהום, אובדן מדגם underestimation עקב מיצוי יעילות, יתר על כן, רוב חומרי ניקוי אינם תואמים LC/MS. ב שיטת HPLC-ECD הנוכחי, דגימות HPLC בקלות ניתן להפריד מהמסנן באמצעות אגרוף חלול פשוטה וללא הדרישה של תהליך הכנת דוגמאות נוספות. האזור של המדגם בצורת עגול נמצא 28.3 מ”מ2, שהוא קטן מאוד בהשוואה לגודל של המסנן קוורץ המקורי (8 x 10 אינץ = 203.2 x 254 מ מ = 51,600 מ מ2).
התנאי HPLC-ECD נצפה היטב כדי למנוע הפרעה לאות 3-NT, כפי שתואר לעיל12. PH חומצי חזק של שלב ניידים וריכוז נאותה של acetonitrile חשוב לצורך זיהוי. שימוש בתנאים אלה, ניתן להפריד תרכובות אחרות, כולל בסיס, ניטרו מן nitrotyrosine. המצב הקיים מתאים זיהוי 3-NT מדגימות בעלי מאפיין פיזי שונה (למשל, חלקיקי ו פלזמה).
כדי להעריך את 3-NT באוויר, את מידת משקל מסנן חיסול הרקע הם שלבים קריטיים. באופן כללי, על פני כ- 100 מ ג של PM7 נאספים על פני תקופה של ארבעה עד שבעה ימים; עם זאת, מספר גורמים להשפיע על המשקל מסנן לפני ואחרי האוסף7 PM, כולל מטען חשמלי סטטי חום ולחות. כדי למנוע תופעות אלה, הייצוב של המשקל מסנן לתקופות ארוכות הכרחי תחת subequal טמפרטורה ולחות. המיקום שבו מותקן האיזון אלקטרונית לשמור על סביבה יציבה. על הכנת הדוגמא, חשוב לתקן את ההשפעות רקע מ פרוטאז לא ספציפית הקוקטיילים ואת קרום אולטראפילטרציה, אשר לעתים קרובות להציג לשיא דומה ל 3-NT.
בשיטה זו ניתן ליישם חלקיקים אחרים, כולל אלה בסביבות מקורה. ניטרציה של חלבונים עשויה להגדיל את פוטנציאל אלרגני2. לכן, שיטה זו עשויה לסייע להעריך ניקיון הסביבה ולמנוע nitrosative מתח.
במחקר זה, אנו מדווחים על שיטת מדידה רגישה מאוד 3-NT אטמוספרי של מסנני אוויר סמפלר עם מנגנון אחיזה נוחה וזולה. דור 3-NT באווירה משויכת מזהמים סביבתיים כגון O3, לא2, חלבונים PM ואלמנטים אשר משפיעים על האדם allergenicity. לסיכום, שיטת פותח בחקירה נוכח עשוי לעזור כדי להעריך את התגובה עם אווירה של O3, מזהמים שונים, וחלבונים PM תחת תנאים מטאורולוגיים שונים. במאמצים אלה לפתח HPLC-ECD עבור הערכת 3-nitrotyrosine באטמוספרה, אנו צופים יותר ניקיון סביבתי, לשפר את בריאות האדם.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה יתבוננו Kubo של אותנו הסוכנות להגנת הסביבה על עזרתו עם כפית/PM2.5 הדגימה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי JSPS KAKENHI גרנט מספר JP16K15373 ו- JP18H03039.
Materials
| Quartz filter, backup quartz filter | PALL life sciences | 7204 | Tissuquatrz 2500QAT-UP, 8x10in |
| High-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | HV-1000F | |
| Particle size selector for SPM | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | 080130-061 | SPM (suspended particulate matters) is defined in Japan that particles with 10 um of 100% cut-off diameter. SPM is almost identical to PM7. |
| Low-volume air sampler | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600F | |
| Size classification unit for PM2.5 | SIBATA SCIENTIFIC TECHNOLOGY | AH-600 | |
| Quartz filters for classification (PM4.5–2.5, PM7.3–4.5, PM15–7.3, and TSP-PM15) | Tokyo Dylec | AHQ-630 | |
| Non-specific protease cocktail | Roche | 11459643001 | Pronase from Streptomyces griseus |
| 3-Nitrotyrosine | SIGMA | N7389 | |
| Ultrafiltration membranes | Millipore | UFC5010BK | AMICON ULTRA 0.5 mL – 10kDa cutoff |
| ECD | Eicom | HTEC-500, PEC-510 | standalone HPLC-ECD unit (HTEC-510) and Pre-electrolysis cell (PEC-510), includes pump |
| HPLC column | Eicom | SC-5ODS | |
| Data processor | Eicom | EPC-300 | |
| Injector | Hitachi High-Tech Science | L-7200 | Auto sampler |
| Analyzing software | eDAQ Japan | ES280 | PowerChrom software |
References
- Castillo, J. A., Staton, S. J. R., Taylor, T. J., Herckes, P., Hayes, M. A. Exploring the feasibility of bioaerosol analysis as a novel fingerprinting technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 403 (1), 15-26 (2012).
- Franze, T., Weller, M. G., Niessner, R., Pöschl, U. Protein nitration by polluted air. Environmental Science & Technology. 39 (6), 1673-1678 (2005).
- Abe, R. Y., Akutsu, Y., Kagemoto, H. Protein amino acids as markers for biological sources in urban aerosols. Environmental Chemistry Letters. 14 (1), 155-161 (2016).
- D’Amato, G., et al. Allergenic pollen and pollen allergy in Europe. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 62 (9), 976-990 (2007).
- Bolzacchini, E., et al. Gas-phase reaction of phenol with NO3. Environmental Science & Technology. 35 (9), 1791-1797 (2001).
- Shiraiwa, M., et al. Multiphase chemical kinetics of the nitration of aerosolized protein by ozone and nitrogen dioxide. Environmental Science & Technology. 46 (12), 6672-6680 (2012).
- Gruijthuijsen, Y. K., et al. Nitration enhances the allergenic potential of proteins. International Archives of Allergy and Immunology. 141 (3), 265-275 (2006).
- Kubo, M., Ogino, K., Tsukahara, H., Kaneko, K. Analytical Procedures for Nitrative/Nitrosative Stress. Studies on Pediatric Disorders. , 149-158 (2014).
- Thomson, L. 3-nitrotyrosine modified proteins in atherosclerosis. Disease Markers. 2015, 708282 (2015).
- Kuhn, D. M., Sakowski, S. A., Sadidi, M., Geddes, T. J. Nitrotyrosine as a marker for peroxynitrite-induced neurotoxicity: the beginning or the end of the end of dopamine neurons?. Journal of Neurochemistry. 89 (3), 529-536 (2004).
- Teixeira, D., Fernandes, R., Prudêncio, C., Vieira, M. 3-Nitrotyrosine quantification methods: Current concepts and future challenges. Biochimie. 125, 1-11 (2016).
- Hitomi, Y. H., et al. Disposition of protein-bound 3-nitrotyrosine in rat plasma analysed by a novel protocol for HPLC-ECD. Journal of Biochemistry. 141 (4), 495-502 (2007).
- Ogino, K., Wang, D. -. H. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention. Acta Medica Okayama. 61 (4), 181-189 (2007).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. -. T., Gutzki, F. -. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 827 (1), 146-156 (2005).
- Ito, T., Ogino, K., Nagaoka, K., Takemoto, K. Relationship of particulate matter and ozone with 3-nitrotyrosine in the atmosphere. Environmental Pollution. 236, 948-952 (2018).
