利用高效液相色谱-电化学检测仪检测大气环境中的 3-硝基酪氨酸

1. 总悬浮粒子、pm2.5或 pm7 的收集, 以及 pm 蛋白的水解方法 从预筛选器或备份筛选器收集 pm。 在收集总悬浮颗粒 (tsp)、pm2.5和 pm7之前, 对石英滤清器进行称重。注: 鉴于 pm 蛋白和肽的污染不应影响酪氨酸硝化的检测 (因为它们缺乏这样的硝基组), 我们在测量前没有在高温下处理石英过滤器。此外, 石英滤清器中的3-nt 含量低于 hplc-ecd 确定的检测极限。 将石英滤清器设置在具有粒径选择器的大容量空气采样器上, 以 1, 000 lmmin 的流量连续收集 pm7 , 持续为 7d (图 1 b)。tsp 可以在没有尺寸选择器的石英过滤器上收集 (图 1a)。 使用小体积空气采样器收集 pm 2.5, 其尺寸分类单元连续为 116 lmin, 流量为 7d. 使用该装置, 颗粒可分为 pm4.5-2.5、pm7.5-4.5、pm 15-7.3 和 tspp-pm15并收集到石英过滤器进行分类。pm2.5可以收集到备份筛选器 (图 1c)。 记录筛选器收集时的总流量。通过从收集后的权重中减去预紧重量, 测量过滤器上 tsp、pm2.5和 pm7的重量。将过滤器密封在塑料袋中, 并将其存放在-30°c, 直到下一步 (见第2节)。 蛋白质溶解样品。 用 0.1 m 醋酸盐缓冲液 (ph 7.4) 溶解非特异性蛋白酶鸡尾酒。将溶液放入透析膜 (分子量截止 = 5, 000 达) 中, 在4°c 下搅拌, 将其浸入1升 0.1 m 醋酸盐缓冲液中。每12小时更换2倍缓冲液, 然后在夜间进行透析, 以去除内源性3-nt 和亚硝酸盐 (no2-)。透析后, 采用双氯酸 (bca) 蛋白法收集溶液, 测定蛋白质浓度。 从预过滤器或备用滤清器中打出6毫米的圆圆, 并将其放入微管中。分析最多可使用 5个6毫米分数的部分 (图 2)。 在试管中加入 300μl 0.1 m 醋酸盐缓冲液, 其中含有50微克的蛋白质, 1.2.1 步骤制备), 在50°c 时旋转16小时水解 pm 蛋白。注: 要从非特异性蛋白酶鸡尾酒溶液中减去内源性 3-nt, 有必要制备和消化仅有特异性蛋白酶的鸡尾酒样本。 由于在膜中污染了类似于 3 nt 的化学物质, 通过添加 0.1 m 醋酸盐缓冲液和离心 (10, 000 x g 30秒; 确切速度取决于膜), 将超滤膜及其供应的管冲洗。重复冲洗1x。 在蛋白质溶解后, 将样品以 2, 500 x 克的速度离心 10分钟, 将上清液装入超滤膜, 并以 10, 000 x 克和4°c 的温度离心进行超滤 (mwco = 10, 000), 直到收集到足够的洗脱量。将凹漆存放在4°c 的黑暗中。注意: 由于在自旋柱中检测到与3-nt 相似的峰值, 因此在使用前必须用干净的水或使用高效液相色谱水和 0.1 m 醋酸盐缓冲液等缓冲液将其洗好。 2.通过高效液相色谱和电化学检测 (hplc-ecd) 系统测定 tsp、pm2.5和 pm7中的3-nt 含量 注意: 请参见图 3。 准备移动阶段。 制备 0.2 m 磷酸盐缓冲液 (ph 值 2.5), 含有 50 mg/l edta。测量98卷缓冲液和两卷乙腈 (hplc 级), 将其倒入干净的玻璃瓶中, 并与瓶盖大力混合。 在室温下设置流动阶段数小时, 直到溶解的空气变平。注意: 如果系统启动较早, 移动相位可以在真空下进行声纳和脱气。然而, 过度脱气会通过蒸发改变水和有机相之间的比例。 hplc-ecd 系统由泵、高效液相色谱柱、脱气器、ecd 和喷油器组成。平衡移动相位, 稳定系统, 减少背景和噪音。 在高效液相色谱系统中安装流动相和高效液相色谱柱。打开高效液相色谱泵, 在25°c 柱温度下, 从开始的前一天起, 将流动相的柱稳定在500μlmmin 的温度下。 第二天, 点燃 ecd 并设置参数 (降低电压为-900 mv, 励磁电压为 400 mv)。稳定它至少3小时。 测量下午7中的3-nt 浓度。 在 0.1 m 醋酸盐缓冲液中制备各种浓度的3-nt 标准 (5-500 nm) 和空白 (没有3-nt 标准和非特异性蛋白酶鸡尾酒, 以确保小瓶和缓冲液都不被污染)。 运行高效液相色谱数据处理器。 将样品瓶放入自动喷射器中, 并将注射体积设置为 25μl. 操作步骤2.2.1 中提到的相同的移动相位和流速条件。注: 如果样品制备完成, 应该有样品、标准样品 (5-500 nm)、仅有非特异性蛋白酶鸡尾酒的样品和一个空白小瓶。 确保色谱图中的基线为平坦, 并开始样品注射。注: 一般情况下, 3-nt 在20-21分钟内被检测到;但是, 建议使用大约30分钟作为每个样品注入的运行时间。否则, 污染物峰值将包括在下一次运行中。 3. pm 中3-nt 含量的色谱分析和定量 7 检查色谱图中的3-nt 峰值并计算内容。 数据收集完成后, 使用分析软件打开色谱数据文件。 从平坦基线绘制一条穿过3-nt 峰值的线, 并从绘制的线读取峰值高度。注: 定量极限约为 5 nm (25μl 注射中的 125 fmol)。注意: ecd 中的电极会慢慢耗尽, 并且由于 sw 比的原因, 电极的极限会很高。 从3-nt 标准峰值准备一条回归线, 计算斜率, 并拦截。 将这些常数分配到下面的公式中, 并计算样本中的3-nt 内容, 如下所示。样本 3–nt (nm) = [样品峰–截距]/斜率 eq. (1)注: 标准曲线应很好地表示为 5 nm 和 500 nm 之间的直线。 计算空气环境中的3-nt 和样品小瓶中的 pm 7。 将3-nt 浓度乘以反应体积 (和稀释系数 (如果有的话), 并从圆圈中评估 pm 7 中的绝对3-nt 含量。 测量收集的过滤面积, 并通过以下公式计算总 pm 7 过滤器中的3-nt 含量。总 pm7 = [3-nt 含量在 pm7的圆] x [pm7过滤面积与圆面积的比率] x 226.19 (在摩尔转换为克的情况下) eq (2) 通过将 pm 7 除以总气流量或 pm7重量 (按步骤1.1.3 记录 ) 来评估空气环境中的3-nt 含量或 pm7 。