قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

وتخضع خلايا الثدييات الإجهاد الميكانيكي وناضح والبيوكيميائية، أدى إلى فقدان سلامة غشاء البلازما. دون إعادة ختم سريعة وفعالة، أن تستسلم الخلايا التالفة بسرعة حتى الموت المبرمجة أو نخرية. منذ الستينات، وكان الدافع وراء الجهود الرامية إلى فهم غشاء البلازما إعادة ختم عملية بالعواقب المدمرة المرتبطة الخلل. في الواقع، قد تم ربط إصلاح غشاء البلازما ناقصة بسبب الطفرات في dysferlin ترميز الجينات، وإنتاج متقدمة glycation المنتجات النهائية، والعيوب في أمراض مثل ضمور العضلات أطرافهم-حزام، والسكري، ومتلازمة Higashi شيدياك منظم CHS1، على التوالي^1،2،،من^34،،من⁵⁶الليزوزومية من الاتجار بالبشر. ومع ذلك، حتى الآن، أن فهمنا للغشاء إعادة ختم هو ما زالت محدودة⁷. وقد أثبتت الدراسات الأولية أن إعادة ختم الغشاء يتم تهيئتها بواسطة تدفق خارج الخلية Ca^{2 +} من خلال غشاء البلازما التالفة^8،،من⁹¹⁰. ومنذ ذلك الحين، عدة غير التبادلية Ca^{2 +}-تعتمد آليات قد اقترحت إعادة ختم الخلايا. وتقترح فرضية التصحيح أن حويصلات داخل الخلايا بالقرب من الجرح، تلتحم مع بعضها البعض وغشاء البلازما التالفة بمثابة تصحيح^11،12،،من¹³¹⁴. نموذج ثاني يقترح أن الرقابة تعتمد على الكالسيوم من lysosomes في الجرح إصدارات موقع سفينجوميليناسي حمض الإنزيمات الليزوزومية، الذي يحول سفينجوميلين إلى السيراميد في النشرة الخارجي من غشاء البلازما. يؤدي هذا التغيير المفاجئ في تكوين الدهن يحركها السيراميد الالتقام المنطقة التالفة^15،،من¹⁶¹⁷. وأخيراً، تنطوي الآلية المقترحة ثالث دور اندوسومال الفرز المعقدة اللازمة للنقل (اسكرت) لتشجيع تشكيل حويصلات المواجه للخارج أن برعم قبالة من غشاء البلازما¹⁸. حدد فقط مجموعة محدودة من البروتينات في هذه النماذج، ويجب كذلك توضيح آلياتها.

هنا يصف لنا مقايسة الفائق الذي توسط التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات ملتصقة تعرض للتلف المؤتلف ليستيريوليسين س (LLO)¹⁹. LLO السم تشكيل المسام (بفت) يفرزها الممرض داخل الخلايا اختياري الليستريه المستوحدة^20،،من²¹²² وينتمي إلى مكف/مركز السيطرة على الأمراض (مجمع الهجوم غشاء، بيرفورين، و فوق عائلة سيتوليسين تعتمد على نسبة الكولسترول في الدم). ماكبف تشكيل المسام الثدييات التي تنتجها البروتينات المشاركة في الدفاعات المناعية، بينما المؤلفان السموم البكتيرية أساسا إيجابية العوامل الممرضة التي تضر بالخلايا المضيفة النهوض أنماط الحياة الممرضة²³. يتم توليف المؤلفان مونومرات للذوبان في الماء أو dimers التي تربط الكولسترول الموجودة في غشاء البلازما، وأوليجوميريزي إلى مجمع بربري من وحدات فرعية تصل إلى 50. ثم يعيد ترتيب بربري المعقدة لإدراج β-خيوط عبر بلير الدهن، تشكيل مسام بيتا للبرميل الذي يمتد 30-50 نانومتر في قطرها^24،25،،من²⁶²⁷.  هذه المسام كبيرة تسمح بتدفق الأيونات والمكونات الخلوية الصغيرة داخل وخارج الخلية؛ رغم ذلك، وقد اقترحت بعض الدراسات أن مسام أصغر حجماً هي أيضا شكلت^28،،من²⁹³⁰. بين المؤلفان، يعرض LLO خصائص فريدة من نوعها، بما في ذلك التجميع تعتمد درجة الحموضة ودرجة الحرارة لا رجعة فيه، مما يفضي إلى تحليلات الفائق^31،32. يمكن إضافة LLO إلى مستنبت الخلية في 4 ˚C، درجة حرارة متساهلة إلى ملزمة لها للخلايا، ولكن ليس إلى تشكيل المسام المعقدة. ثم يمكن أن تكون متزامنة الشروع في تشكيل المسام برفع درجة الحرارة إلى 37 ˚C، مما يسمح لنشر فعالة من الجزيئات السمية في طائرة الغشاء بشكل ليغومرات ويعيد البناء كونفورماشونال المشاركة في توليد المسام. ولذلك، يلي رمز التبديل في درجة الحرارة، والحركية لتلف الخلايا يعتمد على مقدار السمية منضمة إلى غشاء البلازما. الأهم من ذلك، LLO القابلة للذوبان (ليست ملزمة بغشاء البلازما) بسرعة وبلا رجعة المجاميع عند درجة حرارة تصل إلى 37 ˚C، مما يخفف من الحاجة إلى يغسل الجزيئات السمية غير منضم ويحد من مدى الضرر الغشاء على مر الزمن. وأخيراً، لأن LLO تربط بين الكوليسترول وأشكال المسام في الأغشية الغنية بالكولسترول، هذا التحليل قابلة لمجموعة واسعة من خلايا الثدييات. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن LLO يؤثر على الخلية المضيفة إشارات أساسا عن طريق تشكيل المسام، مع استثناءات قليلة في خلية مستقلة عن المسامية التي قد تحدث مما يشير إلى^{33،34،35،36 ،37،،}من³⁸³⁹. ولذلك، فإنه لا يمكن استبعاد أن LLO مما يشير إلى أنشطة قد تؤثر على عملية إصلاح غشاء.

ويقيم هذا التحليل مباشرة مدى إصابة الخلية بقياس إدماج خلية إيمبيرمينت fluorochrome (مثلاً، يوديد propidium) الذي يدخل الخلايا الجرحى سلبية ويصبح الفلورية العالية بمجرد أنه يربط مع الأحماض النووية . ومن ثم، يمكن الحفاظ على فلوروتشرومي في مستنبت الخلية طوال هذه التجربة، السماح للتحليلات في الوقت الحقيقي للخلية مما أسفر عن إصابة. كثافة fluorescence صبغ الحمض النووي الملزمة سوف تزيد مع تركيز السمية، لتركيز معين من السمية، سوف تزيد مع مرور الوقت حتى تتشكل جميع المسام، وهي إصلاح الخلايا تماما أو حتى يتم التوصل إلى التشبع. تدفق خارج الخلية Ca^{2 +} من خلال مسام الغشاء حدث شرط أساسي لإعادة ختم. ولذلك، يمكن أن يدل كفاءة ريسيلينج غير مباشر بمقارنة إصابة خلية في المتوسط الثقافة التي تحتوي على Ca^{2 +} (حالة الإصلاح الدلالية) لإصابة في Ca^{2 +}-المتوسطة الحرة (إصلاح الشرط التقييدي). نظراً لكثافة fluorescence صبغ الحمض النووي ملزم طرديا مع تركيز خلية في كل بئر، من المهم أن خلايا البذور في تركيز نفسها في جميع الآبار. من المهم أيضا أن تعداد الخلايا في كل بئر قبل وبعد الفحص لضمان أن الخلية المفرزة لم تحدث، كعائم، الخلايا المجمعة يمكن أن تحجب fluorescence القراءات التي قد تؤدي إلى تعقيد تفسير البيانات. تعداد الخلايا، والخلايا معربا عن هيستون النووية مترجمة 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل) استخدمت في هذا التحليل. التحكم في درجة الحرارة، وضع متعددة، والقراء الميكروسكوبية الجمع بين القياسات السريعة، الفائق (باستخدام تنسيق لوحة 96 أو 384-جيدا) من شدة الأسفار مع التصوير المجهري للخلايا الحية في 37 درجة مئوية. يمكن استخدام هذا الأخير لعد عدد الخلايا ومراقبة تشكيل خلية متميزة السكان في نهاية المطاف.

في نهاية المطاف، هذا الفحص يوفر للمستخدمين القدرة على توسيع معرفتهم بتعقيد آليات إصلاح الغشاء بالكشف عن الجزيئات المضيف أو إصلاح المركبات مناشئ المضافة التي يمكن التحكم في الغشاء. البروتوكول التالية توضح الخطوات التجريبية لقياس كفاءة الخلايا المعرضة ل LLO ريسيلينج وتقييم آثار المخدرات معين أو العلاج الخلوي في كفاءة إعادة ختم.