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Abstract
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免疫与感染

Máquina de aprendizaje y sin etiqueta de identificación de subtipos de linfocitos usando proyección de imagen tridimensional fase cuantitativa

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Se describe un protocolo para la identificación de subtipos de linfocitos usando proyección de imagen de fase cuantitativa y un algoritmo de aprendizaje automático libre de etiqueta. Las mediciones de índice de refracción 3D tomogramas de linfocitos presentan 3D información morfológica y bioquímica de células individuales, que luego se analiza con un algoritmo de aprendizaje automático para la identificación de tipos de la célula.

Abstract

Describimos aquí un protocolo para la identificación de subtipos de linfocitos usando proyección de imagen de fase cuantitativa y el aprender de máquina libre de etiqueta. La identificación de subtipos de linfocitos es importante para el estudio de la inmunología, así como diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades. En la actualidad, los métodos estándar para la clasificación de tipos de linfocitos dependen de etiquetado de proteínas de membrana específicas mediante reacciones antígeno-anticuerpo. Sin embargo, estas técnicas de etiquetado llevan los riesgos potenciales de alteración de las funciones celulares. El protocolo descrito aquí supera estos desafíos aprovechando intrínsecos contrastes ópticos mide la proyección de imagen 3D fase cuantitativa y un algoritmo de aprendizaje automático. La medición de los tomogramas 3D índice de refracción (RI) de linfocitos proporciona información cuantitativa sobre morfología 3D y fenotipos de células individuales. Los parámetros biofísicos extraídos de los tomogramas de RI 3D medidos entonces se analizan cuantitativamente con un algoritmo de aprendizaje de máquina, permitiendo libre de etiqueta de identificación de tipos de linfocitos a nivel unicelular. Medimos los tomogramas RI 3D de linfocitos B, T CD4 + y T CD8 + e identifica los tipos de la célula con más del 80% exactitud. En este protocolo, se describen los pasos detallados para aislamiento de linfocitos, la proyección de imagen 3D fase cuantitativa y el aprender de máquina para identificar los tipos de linfocitos.

Introduction

Los linfocitos pueden clasificarse en varios subtipos, incluyendo B, helper (CD4 +) T, T citotóxico (CD8 +) y T reguladora las células. Cada tipo de linfocito tiene un papel diferente en el sistema inmune adaptativo; por ejemplo, los linfocitos B producen anticuerpos, mientras que los linfocitos T detectan antígenos específicos, eliminan las células anormales y regulan los linfocitos B. Regulación y la función del linfocito es firmemente controlado por y relaciona con diversas enfermedades, incluyendo cáncer1, enfermedades autoinmunes2y3de las infecciones virales. Por lo tanto, la identificación de tipos de linfocitos es importante entender su papel fisiopatológico en este tipo de enfermedades y para inmunoterapia en clínicas.

Actualmente, métodos para clasificar los tipos de linfocitos se basan en reacciones antígeno-anticuerpo dirigiéndose a proteínas de membrana específicas de superficie o marcadores de superficie4. Marcadores de superficie de fijación de objetivos son un método preciso y exacto para determinar tipos de linfocitos. Sin embargo, requiere procedimientos desperdiciadores de tiempo y reactivos costosos. Además, conlleva riesgos de la modificación de las estructuras de la proteína de la membrana y la alteración de las funciones celulares.

Para superar estos retos, el protocolo descrito aquí introduce la identificación etiqueta-libre de tipos de linfocitos mediante fase cuantitativa 3D imaging (QPI) y machine learning5. Este método permite la clasificación de los tipos de linfocitos a nivel unicelular, basado en información morfológica extraída de la proyección de imagen 3D sin etiqueta de linfocitos individuales. A diferencia de técnicas de microscopía de fluorescencia convencional, QPI utiliza el índice de refracción (RI) distribuciones (propiedades ópticas intrínsecas de células vivas y tejidos) como contraste óptico6,7. Los tomogramas RI de linfocitos individuales representan fenotípica información específica de los subtipos de linfocitos. En este caso, sistémicamente utilizar 3D RI tomogramas de linfocitos individuales, se utilizó un algoritmo de aprendizaje supervisado de la máquina.

Utilizando diversas técnicas QPI, los tomogramas RI 3D de las células han sido activamente utilizados para el estudio de la fisiopatología celular porque proporcionan una etiqueta libre, cuantitativo de imagen capacidad8,9,10, 11,12,13. También, las distribuciones RI 3D de células individuales pueden proporcionar información morfológica, bioquímica y biomecánica sobre las células. Los tomogramas RI 3D se han utilizado anteriormente en los campos de Hematología14,15,16,17, enfermedades infecciosas18,19, 20, Inmunología21, celular biología22,23, inflamación24, cáncer25, neurociencia26,27,28de la biología del desarrollo, toxicología 29y Microbiología12,30,31,32.

Aunque 3D tomogramas de RI proporcionan toda la información morfológica y bioquímica de las células, la clasificación de subtipos de linfocitos es difícil de lograr por simplemente la proyección de imagen 3D de los tomogramas RI5. Sistemáticamente y cuantitativamente explotar los medida 3D tomogramas de RI para la clasificación del tipo de célula, se utilizó un algoritmo de aprendizaje de máquina. Recientemente, varios trabajos han reportado en que fase cuantitativa se analizaron imágenes de células con varios máquina aprender algoritmos33, incluyendo la detección de microorganismos34, clasificación de Género bacteriano35 , 36, detección rápida y etiqueta-libre de esporas de ántrax37, había automatizado análisis de espermatozoides38, análisis de cáncer las células39,40y la detección de activación de macrófagos41.

Este protocolo proporciona pasos detallados para realizar libre de etiqueta de identificación de tipos de linfocitos a nivel de célula individual utilizando 3D QPI y el aprender de máquina. Esto incluye: aislamiento 1) del linfocito de la sangre de ratón, 2) linfocitos clasificación mediante extracción característica 4) cuantitativos flujo cytometry, QPI 3) 3D, 3D tomogramas de RI y aprendizaje 5) actividades para identificar los tipos de linfocitos.

Protocol

Cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron bajo la aprobación de la atención institucional del Animal y uso Comité de KAIST (KA2010-21 KA2014-01 y KA2015-03). Todos los experimentos en este estudio se llevaron a cabo conforme a los lineamientos aprobados. 1. aislamiento linfocitos de sangre de ratón Una vez un ratón C57BL/6J es eutanasia por inhalación de CO2 , inserte una aguja 26-G en el corazón de ratón y recoger 0,3 mL de sangre. …

Representative Results

Figura 1 muestra el proceso esquemático de todo protocolo. Utilizando el procedimiento presentado aquí, se aislaron B (n = 149), CD4 + T (n = 95) y T CD8 + (n = 112) los linfocitos. Para obtener información de fase y amplitud en diferentes ángulos de iluminación, se midieron múltiples hologramas 2D de cada linfocito cambiando el ángulo de iluminación (de-60 ° a 60 °). Por lo general, 50 hologramas se pueden utilizar para reconstruir un tomograma…

Discussion

Presentamos un protocolo que permite la identificación de etiqueta-libre de tipos de linfocito, aprovechando la proyección de imagen 3D fase cuantitativa y el aprender de máquina. Pasos críticos de este protocolo son la selección de la proyección de imagen y función fase cuantitativa. Para la proyección de imagen olográfica óptima, la densidad de células debe ser controlada como se describe anteriormente. Estabilidad mecánica de las células es importante para obtener una distribución precisa de RI 3D porque…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el KAIST BK21 + programa, Tomocube, Inc. y la nacional investigación Fundación de Corea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, K 2018 000396). Y. Jo reconoce apoyo de la beca presidencial KAIST y becas de ciencia biomédica de la Fundación de Asan.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
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References

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Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
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