JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
Introduction
Protocol
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免疫与感染

Livre etiqueta de identificação dos subtipos de linfócito utilizando imagens tridimensionais fase quantitativa e aprendizagem de máquina

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Descreveremos um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medições de índice de refração 3D tomograms de linfócitos apresentam 3D informações morfológicas e bioquímicas para células individuais, que é, então, analisadas com um algoritmo de aprendizado de máquina para identificação dos tipos de células.

Abstract

Descrevemos aqui um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e aprendizado de máquina. Identificação dos subtipos de linfócito é importante para o estudo da imunologia, bem como diagnóstico e tratamento de várias doenças. Atualmente, métodos padrão para a classificação dos tipos de linfócitos dependem de rotulagem de proteínas de membrana específicas via reações antígeno-anticorpo. No entanto, essas técnicas de rotulagem carregam os riscos potenciais de alterar funções celulares. O protocolo descrito aqui supera esses desafios, explorando contrastes ópticos intrínsecos, medidos pela imagem latente 3D fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medição de tomograms 3D Índice de refração (RI) de linfócitos fornece informações quantitativas sobre morfologia 3D e fenótipos das células individuais. Os parâmetros biofísicos extraídos o tomograms 3D medido do RI são então analisados quantitativamente com um algoritmo de aprendizagem de máquina, permitindo a identificação de rótulo livre de tipos de linfócitos em um nível de célula única. Medimos o 3D tomograms RI de linfócitos B, T CD4 + e CD8 + T e identificados os tipos de células com mais de 80% exatidão. Este protocolo, descreveremos as etapas detalhadas para isolamento de linfócitos, imagem 3D fase quantitativa e aprendizado de máquina para identificar tipos de linfócitos.

Introduction

Os linfócitos podem ser classificados em vários subtipos, incluindo B, auxiliar T (CD4 +), citotóxicos (CD8 +) T e T reguladora células. Cada tipo de linfócito tem um papel diferente no sistema imune adaptativo; por exemplo, os linfócitos B produzem anticorpos, Considerando que os linfócitos T detectam antígenos específicos, eliminam as células anormais e regulam os linfócitos B. Regulamento e função de linfócitos é firmemente controlado pelo e relacionados a várias doenças, incluindo infecções virais3, cancros1e doenças auto-imunes2. Assim, a identificação dos tipos de linfócitos é importante entender seus papéis fisiopatológicos em tais doenças e para imunoterapia em clínicas.

Atualmente, métodos de classificação de tipos de linfócitos dependem de reações antígeno-anticorpo alvejando proteínas específicas da membrana de superfície ou marcadores de superfície4. Direcionamento de marcadores de superfície é um método preciso e exato para determinar os tipos de linfócitos. No entanto, requer reagentes caros e procedimentos demorados. Além disso, ele carrega os riscos da modificação das estruturas de proteína de membrana e a alteração das funções celulares.

Para superar esses desafios, o protocolo descrito aqui introduz a identificação de rótulo livre de linfócitos tipos usando 3D fase quantitativa de imagem (QPI) e máquina de aprendizagem5. Esse método permite a classificação dos tipos de linfócitos em um nível de célula única com base nas informações morfológicas extraídas de imagem em 3D livre de rótulo de linfócitos individuais. Ao contrário de técnicas de microscopia de fluorescência convencional, QPI utiliza o índice de refração (RI) distribuições (intrínsecas propriedades óticas de células vivas e tecidos) como contraste óptico6,7. Os tomograms RI de linfócitos individuais representam informação fenotípica específica para os subtipos de linfócitos. Neste caso, para utilizar sistemicamente 3D tomograms RI de linfócitos individuais, foi utilizado um algoritmo de aprendizado de máquina supervisionado.

Usando várias técnicas QPI, os 3D tomograms RI de células têm sido ativamente utilizados para o estudo da fisiopatologia da célula porque eles fornecem um rótulo livre, quantitativa de imagem capacidade8,9,10, 11,12,13. Além disso, as distribuições de RI 3D de células individuais podem fornecer informações morfológicas, bioquímicas e biomecânicas sobre células. 3D do RI tomograms tenha sido previamente utilizados nos campos da hematologia14,15,16,17, doenças infecciosas18,19, 20, imunologia21célula biologia22,23, inflamação24, câncer25, neurociência26,27, biologia do desenvolvimento28, toxicologia 29e Microbiologia12,30,31,32.

Embora 3D RI tomograms fornecem informações detalhadas morfológicas e bioquímicas das células, a classificação dos subtipos de linfócito é difícil de alcançar por simplesmente imagem 3D RI tomograms5. Explorarem sistematicamente e quantitativamente a medida tomograms RI 3D para a classificação do tipo de célula, utilizamos um algoritmo de aprendizado de máquina. Recentemente, diversos trabalhos têm sido relatados em qual fase quantitativa, analisaram-se imagens de células com várias máquina aprendendo algoritmos33, incluindo a detecção de microorganismos34, classificação de género bacteriana35 , 36, detecção rápida e livre de rótulo de esporos de antraz37, automatizado de análise de espermatozoides38, análise de células de câncer39,40e detecção de ativação de macrófagos41.

Este protocolo fornece etapas detalhadas para executar livre de etiqueta de identificação de tipos de linfócitos no nível da célula individual usando 3D QPI e aprendizado de máquina. Isto inclui: isolamento 1) linfócitos do sangue de rato, 2) linfócito classificação através de fluxo cytometry, QPI 3) 3D, 4) quantitativos extração do 3D do RI tomograms e aprendizado 5) supervisionado para a identificação de tipos de linfócitos.

Protocol

Cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados sob a aprovação dos cuidados institucionais do Animal e uso Comitê de KAIST (KA2010-21, KA2014-01 e KA2015-03). Todas as experiências neste estudo foram realizadas em conformidade com as diretrizes aprovadas. 1. linfócitos isolado do sangue de rato Uma vez um rato C57BL/6J é eutanásia por inalação de CO2 , introduza uma agulha 26-G o coração de rato e recolher 0,3 mL de sangue. Diretamente coloc…

Representative Results

Figura 1 mostra o processo esquemático do protocolo inteiro. Usando o procedimento aqui apresentado, isolamos B (n = 149), CD4 + T (n = 95) e CD8 + T (n = 112) linfócitos. Para obter informações de fase e amplitude em diferentes ângulos de iluminação, múltiplos hologramas 2D de cada linfócito foram medidos, alterando o ângulo de iluminação (de-60 ° a 60 °). Normalmente, 50 hologramas podem ser usados para reconstruir uma tomografia 3D do RI,…

Discussion

Apresentamos um protocolo que permite a identificação de rótulo livre dos tipos de linfócitos, explorando a imagem 3D fase quantitativa e aprendizado de máquina. Passos críticos do presente protocolo são fase quantitativa de imagem e o recurso seleção. Para a ideal de imagem holográfica, a densidade de células deve ser controlada como descrito acima. Estabilidade mecânica das células também é importante para obter uma distribuição de RI 3D precisa porque movimentos celulares flutuantes ou vibracionais pe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela KAIST BK21 + programa, Tomocube, Inc. e da National Research Foundation da Coreia (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo reconhece apoio do KAIST presidencial Fellowship e bolsa de ciência biomédica Asan Foundation.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
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References

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Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
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