Identificazione dei sottotipi del linfocita usando la formazione immagine tridimensionale fase quantitativa privo di etichetta e Machine Learning
Summary
Descriviamo un protocollo per l’identificazione di sottotipi del linfocita usando formazione immagine fase quantitativa e un algoritmo di apprendimento automatico privo di etichetta. Misurazioni dell’indice di rifrazione 3D tomogrammi dei linfociti presentano 3D informazioni morfologiche e biochimiche per le singole celle, che viene quindi analizzati con un algoritmo di apprendimento automatico per l’identificazione di tipi delle cellule.
Abstract
Descriviamo qui un protocollo per l’identificazione di sottotipi del linfocita usando formazione immagine fase quantitativa e apprendimento automatico privo di etichetta. L’identificazione di sottotipi del linfocita è importante per lo studio di immunologia, come pure la diagnosi ed il trattamento di varie malattie. Attualmente, metodi standard per la classificazione dei tipi di linfocita si basano sull’etichettatura di proteine di membrana specifici tramite reazioni antigene-anticorpo. Tuttavia, queste tecniche d’etichettatura trasportano i potenziali rischi di alterare le funzioni cellulari. Il protocollo descritto qui supera queste sfide sfruttando intrinseci contrasti ottici misurati da formazione immagine 3D fase quantitativa e un algoritmo di apprendimento automatico. Misurazione dell’indice di rifrazione 3D (RI) tomogrammi dei linfociti fornisce informazioni quantitative sulla morfologia 3D e fenotipi di singole celle. I parametri biofisici estratti dal misura 3D RI tomogrammi vengono poi analizzati quantitativamente con un algoritmo di apprendimento della macchina, che consente di identificare tipi di linfocita a livello di singola cellula privo di etichetta. Misuriamo i tomogrammi RI 3D dei linfociti B, T CD4 + e CD8 + T e identificati i tipi di cellule con oltre l’80% precisione. In questo protocollo, descriviamo la procedura dettagliata per l’isolamento, imaging 3D fase quantitativa e apprendimento automatico per l’identificazione dei tipi del linfocita.
Introduction
I linfociti possono essere classificati in diversi sottotipi, tra cui B, helper (CD4 +) T, linfociti T citotossici (CD8 +) e T regolatorie cellule. Ogni tipo di linfocita ha un ruolo diverso nel sistema immunitario adattivo; ad esempio, i linfociti B producono anticorpi, mentre i linfociti T rilevare antigeni specifici, eliminano le cellule anormali e regolano i linfociti B. Regolamento e funzione del linfocita è strettamente controllato da e relative alle varie malattie tra cui tumori1, malattie autoimmuni2e infezioni virali3. Così, l’identificazione dei tipi del linfocita è importante comprendere i loro ruoli fisiopatologici in tali malattie e per l’immunoterapia nelle cliniche.
Attualmente, metodi per la classificazione dei tipi di linfocita si basano sulle reazioni antigene-anticorpo targeting proteine specifiche della membrana superficiale o marcatori di superficie4. Targeting per gli indicatori di superficie è un metodo preciso e accurato per determinare i tipi di linfociti. Tuttavia, esso richiede costosi reagenti e lunghe procedure. Inoltre, trasporta i rischi della modificazione della struttura delle proteine di membrana e l’alterazione delle funzioni cellulari.
Per superare queste sfide, il protocollo descritto qui introduce l’identificazione privo di etichetta dei tipi del linfocita usando fase quantitativa 3D imaging (QPI) e machine learning5. Questo metodo consente la classificazione dei tipi di linfocita a livello di singola cellula basato su informazioni morfologiche estratte da imaging 3D privo di etichetta dei singoli linfociti. A differenza delle tecniche di microscopia di fluorescenza convenzionali, QPI utilizza l’indice di rifrazione (RI) distribuzioni (intrinseche proprietà ottiche di tessuti e cellule vive) come contrasto ottico6,7. I tomogrammi RI dei singoli linfociti rappresentano informazioni fenotipiche specifiche ai sottotipi di linfociti. In questo caso, per via sistemica utilizzare 3D RI tomogrammi dei linfociti individuali, è stato utilizzato un algoritmo di apprendimento supervisionato macchina.
Varie tecniche di QPI, i 3D tomogrammi RI delle cellule sono stati attivamente utilizzati per lo studio della fisiopatologia delle cellule perché forniscono un privo di etichetta, quantitativa imaging capacità8,9,10, 11,12,13. Le distribuzioni di RI 3D delle singole celle è anche, in grado di fornire informazioni morfologiche, biochimiche e biomeccaniche sulle celle. 3D RI tomogrammi sono stati precedentemente utilizzati nei settori dell’ematologia14,15,16,17, malattie infettive18,19, 20, immunologia21, cellula biologia22,23, infiammazione24, cancro25, neuroscienze26,27, biologia dello sviluppo28, tossicologia 29e microbiologia12,30,31,32.
Anche se 3D RI tomogrammi forniscono dettagliate informazioni morfologiche e biochimiche delle cellule, la classificazione dei sottotipi del linfocita è difficile da raggiungere da semplicemente imaging 3D RI tomogrammi5. Sfruttare sistematicamente e quantitativamente i misurato tomogrammi RI 3D per la classificazione del tipo di cellula, abbiamo utilizzato un algoritmo di apprendimento della macchina. Recentemente, diverse opere sono stati segnalati in quale fase quantitativa immagini delle cellule sono stati analizzati con vari di machine learning algoritmi33, compresa l’individuazione di microrganismi34, classificazione del genere di batteri35 , 36, rilevazione rapida e privo di etichetta di spore di antrace37, automatizzato di analisi delle cellule dello sperma38, analisi di cancro cellule39,40e la rilevazione di macrofago attivazione41.
Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per eseguire privo di etichetta di identificazione dei tipi del linfocita a livello di singola cella usando 3D QPI e il machine learning. Questo include: 1) l’isolamento dal sangue del topo, 2) dei linfociti l’ordinamento tramite flusso cytometry, 3) 3D QPI, 4) quantitativa funzione di estrazione da 3D RI tomogrammi e apprendimento 5) supervisionato per l’identificazione dei tipi del linfocita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo un protocollo che consente l’identificazione privo di etichetta dei tipi di linfocita sfruttando la fase quantitativa 3D imaging e apprendimento automatico. Fasi critiche del presente protocollo sono fase quantitativa imaging e funzionalità di selezione. Per l’imaging olografico ottima, la densità delle cellule dovrebbe essere controllata come descritto sopra. Stabilità meccanica delle cellule è anche importante per ottenere una precisa distribuzione RI 3D perché movimenti cellulari galleggianti o vib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da KAIST BK21 + programma, Tomocube, Inc e National Foundation Research of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo riconosce sostegno dal KAIST Presidential Fellowship e Asan Foundation Scholarship scienza biomedica.
Materials
| Mouse | Daehan Biolink | C57BL/6J mice | gender and age-matched, 6 – 8 weeks |
| Falcon conical centrifuge tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphate-buffered saline | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammonium-chloride-potassium lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antibody | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (clone 2.4G2) |
| Antibody | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (clone 17A2) |
| Antibody | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (clone 53-6.7) |
| Antibody | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (clone 1D3) |
| Antibody | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (clone RA3-6B2) |
| Antibody | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (clone PK136) |
| Antibody | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (clone GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-diamidino-2-phenylindole |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Aria II or III | |
| Imaging chamber | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomography | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomography imaging software | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image professing software | MathWorks | Matlab R2017b |
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