JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Label-gratis identificatie van lymfocyt subtypen met behulp van drie-dimensionale kwantitatieve fase Imaging en Machine Learning

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Beschrijven we een protocol voor de identificatie van label-vrij van lymfocyt subtypen met behulp van kwantitatieve fase beeldvorming en een machinaal leren algoritme. Metingen van 3D refractive index tomograms van lymfocyten 3D morfologische en biochemische informatie voor individuele cellen, die vervolgens wordt geanalyseerd met een machine-leren algoritme voor de identificatie van celtypes presenteren.

Abstract

Hier beschrijven we een protocol voor de identificatie van label-vrij van lymfocyt subtypen met behulp van kwantitatieve fase beeldvorming en machinaal leren. Identificatie van lymfocyt subtypen is belangrijk voor de studie van zowel immunologie als diagnose en behandeling van verschillende ziekten. Op dit moment afhankelijk standaardmethoden voor het classificeren van lymfocyt typen etikettering van specifieke membraaneiwitten via antigeen-antilichaam reacties. Echter, deze labeling technieken dragen de potentiële risico’s voor het wijzigen van de cellulaire functies. Het protocol beschreven hier overwint deze uitdagingen door te profiteren van de intrinsieke optische contrasten gemeten door 3D kwantitatieve fase beeldvorming en een machinaal leren algoritme. Meting van 3D brekingsindex (RI) tomograms van lymfocyten bevat kwantitatieve gegevens over 3D morfologie en fenotypes van afzonderlijke cellen. De biofysische parameters geëxtraheerd uit de gemeten 3D RI tomograms worden vervolgens kwantitatief geanalyseerd met een machine leren algoritme, label-vrije identificatie op het niveau van een eencellige soorten lymfocyt inschakelen. We meten de 3D RI tomograms van B, CD4 + T en CD8 + T lymfocyten en hun celtypes geïdentificeerd met meer dan 80% nauwkeurigheid. In dit protocol beschrijven we de gedetailleerde stappen voor lymfocyt isolatie, 3D kwantitatieve fase imaging en machinaal leren voor het identificeren van de lymfocyt typen.

Introduction

Lymfocyten kunnen worden ingedeeld in verschillende subtypen met inbegrip van B, helper (CD4 +) T, cytotoxisch (CD8 +) T en regelgevende T cellen. Elk type lymfocyt heeft een andere rol in het adaptieve immuunsysteem; bijvoorbeeld, produceren B-lymfocyten antilichamen, overwegende dat T lymfocyten detecteren van specifieke antigenen, elimineren van abnormale cellen en reguleren van B-lymfocyten. Lymfocyt functie en regulering is strak bestuurd door en gerelateerd aan verschillende ziekten waaronder kanker1, auto-immune ziekten2en virale infecties3. De identificatie van lymfocyt typen is dus belangrijk om te begrijpen hun pathofysiologische rol in dergelijke ziekten en voor de immunotherapie in klinieken.

Op dit moment afhankelijk methoden voor het classificeren van lymfocyt typen antigeen-antilichaam reacties op richten op specifieke oppervlakte membraaneiwitten of oppervlakte markeringen4. Oppervlakte markeringen richten is een precieze en accurate methode om te bepalen van de lymfocyt typen. Nochtans, vereist het dure reagentia en tijdrovende procedures. Bovendien draagt het risico’s van de wijziging van membraan eiwit structuren en de wijziging van cellulaire functies.

Om deze uitdagingen te overwinnen, introduceert het protocol beschreven hier de label-vrije identificatie van lymfocyt typen met behulp van 3D kwantitatieve fase imaging (QPI) en machine leren5. Deze methode kan de indeling van de lymfocyt soorten op een niveau van de eencellige gebaseerd op morfologische informatie etiket-gratis 3D beeldvorming van individuele lymfocyten is onttrokken. In tegenstelling tot conventionele fluorescentie microscopie technieken, QPI maakt gebruik van brekingsindex (RI) distributies (intrinsieke optische eigenschappen van levende cellen en weefsels) als optische contrast6,7. De RI tomograms van individuele lymfocyten vertegenwoordigen fenotypische informatie specifiek voor subtypen van lymfocyten. In dit geval voor het systemisch gebruik van 3D RI tomograms van individuele lymfocyten, werd een gecontroleerde machine leren algoritme gebruikt.

Met behulp van verschillende QPI technieken, de 3D RI tomograms van cellen zijn actief gebruikt voor de studie van cel pathofysiologie omdat ze een label-vrij bieden, kwantitatieve imaging vermogen8,9,10, 11,12,13. Ook kunnen de 3D RI distributies van afzonderlijke cellen informeren morfologische, biochemische en biomechanische over cellen. 3D RI tomograms hebben eerder gebruikt op het gebied van hematologie14,15,16,17, infectieziekten18,19, 20, immunologie,21,22,23van de biologie van de cel, ontsteking24, kanker25, neurowetenschappen26,27, ontwikkelingsbiologie28, toxicologie 29en microbiologie12,30,31,32.

Hoewel 3D RI tomograms gedetailleerde informatie van de morfologische en biochemische van cellen bieden, is de indeling van de lymfocyt subtypen moeilijk te bereiken door simpelweg imaging 3D RI tomograms5. Systematisch en kwantitatief misbruiken de gemeten 3D RI-tomograms voor de cel type indeling, we een machine leren algoritme gebruikt. Onlangs, verscheidene werken zijn gemeld in welke kwantitatieve fase beelden van cellen werden geanalyseerd met verschillende machine leren algoritmen33, met inbegrip van de opsporing van micro-organismen34, classificatie van bacteriële geslacht35 , 36, snelle en label-vrije detectie van miltvuur sporen37, geautomatiseerde analyse van zaadcellen38, analyse van kanker cellen39,40, en detectie van macrofaag activering41.

Dit protocol biedt gedetailleerde stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van label-vrije identificatie op het niveau van de individuele cellen met behulp van 3D QPI en machinaal leren typen lymfocyten. Dit omvat: 1) lymfocyt isolatie van muis bloed, 2) lymfocyt sorteren via stroom cytometry, 3) 3D QPI, 4) kwantitatieve functie extractie van 3D RI tomograms en 5) begeleid leren voor het identificeren van de lymfocyt typen.

Protocol

Verzorging van de dieren en experimentele procedures werden uitgevoerd onder de goedkeuring van de institutionele zorg van het dier en gebruik Comité van KAIST (KA2010-21 KA2014-01 en KA2015-03). Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren. 1. lymfocyt isolatie uit bloed van de muis Zodra een muis C57BL/6J is euthanized via inademing van CO2 , invoegen van een 26-G naald in het hart van de muis en verzamelen van 0.3 mL bl…

Representative Results

Figuur 1 toont de schematische proces van het gehele protocol. Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd, we geïsoleerd B (n = 149), CD4 + T (n = 95), en CD8 + T (n = 112) lymfocyten. Fase en amplitude om informatie te verkrijgen onder verschillende hoeken van de verlichtingssterkte, werden meerdere 2D hologrammen van elke lymfocyt gemeten door het veranderen van de hoek van de verlichtingssterkte (-60 ° tot 60 °). Meestal 50 hologrammen te re…

Discussion

We presenteren een protocol waarmee de identificatie van label-vrije soorten lymfocyt 3D kwantitatieve fase beeldvorming en machinaal leren benutten. Kritische stappen van dit protocol zijn kwantitatieve fase beeldvorming en functie selectie. Voor de optimale holografische beeldvorming, moet de dichtheid van de cellen controleerbaar zijn zoals hierboven beschreven. Mechanische stabiliteit van de cellen is ook belangrijk te verkrijgen van een exacte 3D RI verdeling, omdat zwevende of vibrationele cellulaire moties hologra…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de KAIST BK21 + programma, Tomocube, Inc., en de nationale onderzoek Stichting Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo erkent steun van het KAIST Presidential Fellowship en Asan Stichting biomedische wetenschap beurs.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503 (2000).
  2. Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14 (2010).
  3. Sáez-Cirión, A., et al. HIV controllers exhibit potent CD8 T cell capacity to suppress HIV infection ex vivo and peculiar cytotoxic T lymphocyte activation phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (16), 6776-6781 (2007).
  4. Fischer, K., et al. Isolation and characterization of human antigen-specific TCRαβ+ CD4-CD8-double-negative regulatory T cells. Blood. 105 (7), 2828-2835 (2005).
  5. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654 (2017).
  6. Popescu, G. . Quantitative phase imaging of cells and tissues. , (2011).
  7. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  8. Kim, D., et al. Refractive index as an intrinsic imaging contrast for 3-D label-free live cell imaging. bioRxiv. , 106328 (2017).
  9. Kim, K., et al. Optical diffraction tomography techniques for the study of cell pathophysiology. Journal of Biomedical Photonics & Engineering. 2 (2), (2016).
  10. Wolf, E. Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data. Optics Communications. 1 (4), 153-156 (1969).
  11. Kus, A., Dudek, M., Kemper, B., Kujawinska, M., Vollmer, A. Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046009 (2014).
  12. Kim, T., et al. White-light diffraction tomography of unlabelled live cells. Nature Photonics. 8 (3), 256 (2014).
  13. Simon, B., et al. Tomographic diffractive microscopy with isotropic resolution. Optica. 4 (4), 460-463 (2017).
  14. Kim, Y., et al. Profiling individual human red blood cells using common-path diffraction optical tomography. Scientific Reports. 4, (2014).
  15. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, (2016).
  16. Lee, S., et al. Refractive index tomograms and dynamic membrane fluctuations of red blood cells from patients with diabetes mellitus. Scientific Reports. 7, (2017).
  17. Merola, F., et al. Tomographic flow cytometry by digital holography. Light-Science & Applications. 6, (2017).
  18. Park, Y., et al. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 13730-13735 (2008).
  19. Park, H., et al. Characterizations of individual mouse red blood cells parasitized by Babesia microti using 3-D holographic microscopy. Scientific Reports. 5, 10827 (2015).
  20. Chandramohanadas, R., et al. Biophysics of malarial parasite exit from infected erythrocytes. Public Library of Science ONE. 6 (6), 20869 (2011).
  21. Yoon, J., et al. Label-free characterization of white blood cells by measuring 3D refractive index maps. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3865-3875 (2015).
  22. Kim, K., et al. Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes. Scientific Reports. 6, 36815 (2016).
  23. Kim, D., et al. Label-free high-resolution 3-D imaging of gold nanoparticles inside live cells using optical diffraction tomography. Methods. , (2017).
  24. Lenz, P., et al. Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  25. Huang, J., Guo, P., Moses, M. A. A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  26. Yang, S. A., Yoon, J., Kim, K., Park, Y. Measurements of morphological and biochemical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson’s disease. Cytometry Part A. 91 (5), 510-518 (2017).
  27. Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
  28. Nguyen, T. H., Kandel, M. E., Rubessa, M., Wheeler, M. B., Popescu, G. Gradient light interference microscopy for 3D imaging of unlabeled specimens. Nature Communications. 8 (1), 210 (2017).
  29. Kwon, S., et al. Mitochondria-targeting indolizino [3, 2-c] quinolines as novel class of photosensitizers for photodynamic anticancer activity. European Journal of Medicinal Chemistry. 148, 116-127 (2018).
  30. Bennet, M., Gur, D., Yoon, J., Park, Y., Faivre, D. A Bacteria-Based Remotely Tunable Photonic Device. Advanced Optical Materials. , (2016).
  31. Kim, T. I., et al. Antibacterial Activities of Graphene Oxide-Molybdenum Disulfide Nanocomposite Films. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (9), 7908-7917 (2017).
  32. Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). Journal of Visualized Experiments. (129), (2017).
  33. Jo, Y., et al. Quantitative Phase Imaging and Artificial Intelligence: A Review. arXiv preprint. , (2018).
  34. Javidi, B., Moon, I., Yeom, S., Carapezza, E. Three-dimensional imaging and recognition of microorganism using single-exposure on-line (SEOL) digital holography. Optics Express. 13 (12), 4492-4506 (2005).
  35. Jo, Y., et al. Label-free identification of individual bacteria using Fourier transform light scattering. Optics Express. 23 (12), 15792-15805 (2015).
  36. Jo, Y., et al. Angle-resolved light scattering of individual rod-shaped bacteria based on Fourier transform light scattering. Scientific Reports. 4, 5090 (2014).
  37. Jo, Y., et al. Holographic deep learning for rapid optical screening of anthrax spores. Science Advances. 3 (8), 1700606 (2017).
  38. Mirsky, S. K., Barnea, I., Levi, M., Greenspan, H., Shaked, N. T. Automated analysis of individual sperm cells using stain-free interferometric phase microscopy and machine learning. Cytometry Part A. 91 (9), 893-900 (2017).
  39. Roitshtain, D., et al. Quantitative phase microscopy spatial signatures of cancer cells. Cytometry Part A. 91 (5), 482-493 (2017).
  40. Lam, V. K., Nguyen, T. C., Chung, B. M., Nehmetallah, G., Raub, C. B. Quantitative assessment of cancer cell morphology and motility using telecentric digital holographic microscopy and machine learning. Cytometry Part A. , (2017).
  41. Pavillon, N., Hobro, A. J., Akira, S., Smith, N. I. Noninvasive detection of macrophage activation with single-cell resolution through machine learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  42. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
  43. Takeda, M., Ina, H., Kobayashi, S. Fourier-transform method of fringe-pattern analysis for computer-based topography and interferometry. Journal of the Optical Society of America. 72 (1), 156-160 (1982).
  44. Debnath, S. K., Park, Y. Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm. Optics Letters. 36 (23), 4677-4679 (2011).
  45. Kim, K., et al. High-resolution three-dimensional imaging of red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum and in situ hemozoin crystals using optical diffraction tomography. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011005 (2013).
  46. Vercruysse, D., et al. Three-part differential of unlabeled leukocytes with a compact lens-free imaging flow cytometer. Lab on a Chip. 15 (4), 1123-1132 (2015).
  47. Kim, K., et al. Correlative three-dimensional fluorescence and refractive index tomography: bridging the gap between molecular specificity and quantitative bioimaging. Biomedical Optics Express. 8 (12), 5688-5697 (2017).
  48. Shin, S., Kim, D., Kim, K., Park, Y. Super-resolution three-dimensional fluorescence and optical diffraction tomography of live cells using structured illumination generated by a digital micromirror device. arXiv preprint. , (2018).
  49. Chowdhury, S., Eldridge, W. J., Wax, A., Izatt, J. A. Structured illumination multimodal 3D-resolved quantitative phase and fluorescence sub-diffraction microscopy. Biomedical Optics Express. 8 (5), 2496-2518 (2017).

Tags

Label-freeLymphocyte Subtypes3D Quantitative Phase ImagingMachine LearningFluorescence LabelingFlow CytometryRefractive Index TomographyBlood CancerAutoimmune DiseaseSingle-cell AnalysisBacteria3D Quantitative Phase MicroscopeRPMI MediumDigital Micromirror Device3D Reconstruction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image