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Abstract
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免疫与感染

Machine Learning et sans étiquette d’Identification des sous-types de lymphocytes à l’aide de l’imagerie tridimensionnelle Phase Quantitative

Published: November 19, 2018
doi:
10.3791/58305
, , , , , , ,
1Department of Physics,University of Cambridge, 2Department of Physics,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3KAIST Institute for Health Science and Technology,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 4Tomocube, Inc., 5Department of Chemical and Biomolecular Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 6Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 7Department of Applied Physics,Stanford University

Summary

Les auteurs décrivent un protocole d’identification des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et un algorithme d’apprentissage machine exempte d’étiquette. Mesures de l’indice de réfraction 3D tomographies des lymphocytes présentent 3D informations morphologiques et biochimiques des cellules individuelles, qui sont ensuite analysées grâce à un algorithme d’apprentissage automatique pour l’identification des types de cellules.

Abstract

Nous décrivons ici un protocole d’identification exempte d’étiquette des sous-types de lymphocytes en utilisant l’imagerie quantitative phase et apprentissage automatique. Identification des sous-types de lymphocytes est importante pour l’étude de l’immunologie ainsi que diagnostic et le traitement de diverses maladies. Actuellement, des méthodes standard pour la classification des types de lymphocytes s’appuient sur l’étiquetage des protéines membranaires spécifiques via des réactions antigène-anticorps. Toutefois, ces techniques d’étiquetage portent les risques potentiels d’altérer les fonctions cellulaires. Le protocole décrit ici permet de surmonter ces défis en exploitant les contrastes optiques intrinsèques, mesurés par imagerie 3D volet quantitatif et un algorithme d’apprentissage automatique. Mesure des tomographies 3D indice de réfraction (RI) des lymphocytes fournit des informations quantitatives sur la morphologie 3D et les phénotypes des cellules individuelles. Les paramètres biophysiques extraites des tomographies de RI 3D mesurées sont ensuite quantitativement analysés avec un algorithme d’apprentissage machine permettant une identification des types de lymphocytes au niveau unicellulaire exempte d’étiquette. Nous mesurons les tomographies RI 3D des lymphocytes B, T CD4 + et CD8 + T et identifié leurs types de cellules avec plus de 80 % exactitude. Dans ce protocole, nous décrivons la procédure détaillée pour l’isolement de lymphocytes, l’imagerie 3D volet quantitatif et apprentissage automatique pour l’identification des types de lymphocytes.

Introduction

Les lymphocytes peuvent être classés en différents sous-types dont B, d’assistance (CD4 +) T cytotoxiques (CD8 +) T et T régulateurs des cellules. Chaque type de lymphocyte a un rôle différent dans le système immunitaire adaptatif ; par exemple, les lymphocytes B produisent des anticorps, alors que les lymphocytes T détecter les antigènes spécifiques, d’éliminer les cellules anormales et réglementent les lymphocytes B. Règlement et fonction lymphocytaire est étroitement contrôlée par et associés à diverses maladies dont les cancers1et maladies auto-immunes2infections virales3. Ainsi, l’identification des types de lymphocytes est importante de comprendre leurs rôles physiopathologiques de ces maladies et d’immunothérapie dans les cliniques.

Actuellement, les méthodes de classification des types de lymphocytes s’appuient sur réactions antigène-anticorps en ciblant les protéines de la membrane de surface spécifique ou de marqueurs de surface4. Ciblage des marqueurs de surface est une méthode précise et exacte pour déterminer les types de lymphocytes. Cependant, elle nécessite des réactifs coûteux et procédures fastidieuses. En outre, il comporte des risques de la modification des structures de protéines membranaires et la modification des fonctions cellulaires.

Pour surmonter ces défis, le protocole décrit ici présente l’identification exempte d’étiquette des types de lymphocytes à l’aide de 3D phase quantitative imaging (QPI) et5en apprentissage automatique. Cette méthode permet la classification des types de lymphocytes au niveau cellule unique basée sur l’information morphologique extraite de l’imagerie 3D exempte d’étiquette de lymphocytes individuels. Contrairement aux techniques de microscopie de fluorescence conventionnels, QPI utilise l’indice de réfraction (RI) des distributions (propriétés optiques intrinsèques des tissus et de cellules vivantes) comme contraste optique6,7. Les tomographies RI des lymphocytes individuels représentent des informations phénotypiques spécifiques aux sous-types des lymphocytes. Dans ce cas, pour pouvoir systématiquement utiliser 3D RI tomographies des lymphocytes individuels, un algorithme d’apprentissage supervisé machine a été utilisé.

En utilisant diverses techniques QPI, les 3D tomographies RI des cellules ont été activement utilisées pour l’étude de la physiopathologie de la cellule parce qu’ils fournissent une étiquette libre, quantitative imaging capacité8,9,10, 11,12,13. Aussi, les distributions de RI 3D de cellules individuelles peuvent fournir des informations morphologiques, biochimiques et biomécaniques sur les cellules. 3D RI tomographies ont été précédemment utilisés dans les domaines de l’hématologie14,15,16,17, maladies infectieuses18,19, 20, immunologie21, cell biology22,23, inflammation24, cancer25, neuroscience26,,27,28de la biologie du développement, toxicologie 29et microbiologie12,30,31,32.

Bien que 3D RI tomographies fournissent des détails morphologiques et biochimiques des cellules, la classification des sous-types de lymphocytes est difficile à réaliser par simplement d’imagerie 3D RI tomographies5. Systématiquement et quantitativement exploiter les tomographies de RI 3D mesurées pour la classification de type de cellule, nous avons utilisé un algorithme d’apprentissage machine. Récemment, plusieurs ouvrages ont été signalés, dans quelle phase quantitative des images de cellules ont été analysées avec divers machine learning algorithmes33, y compris la détection des microorganismes34, classification du genre bactérien35 , 36, détection rapide et sans étiquette de l’anthrax spores37, automatisé d’analyse des spermatozoïdes38, analyse des cellules de cancer39,40et la détection de macrophage activation41.

Ce protocole prévoit la procédure détaillée pour effectuer exempte d’étiquette d’identification des types de lymphocytes au niveau des cellules individuelles à l’aide de 3D QPI et apprentissage automatique. Cela inclut : isolement 1) des lymphocytes de sang de souris, lymphocytes 2) Tri par écoulement cytometry, QPI 3) 3D, 4) quantitative trait extraction de 3D RI tomographies et apprentissage 5) supervisé pour identifier les types de lymphocytes.

Protocol

Soins des animaux et des procédures expérimentales ont été effectuées en vertu de l’approbation de l’animalerie institutionnelle et utilisation Comité du KAIST (KA2010-21, KA2014-01 et KA2015-03). Toutes les expériences dans cette étude ont été effectuées conformément aux principes directeurs adoptés. 1. les lymphocytes isolement du sang de souris Une fois une souris C57BL/6J est euthanasiée par inhalation de CO2 , insérer une aiguille 26-G dans le coeur…

Representative Results

Figure 1 montre le processus schématique de l’ensemble du protocole. À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons isolé B (n = 149), lymphocytes T CD4 + (n = 95) et T CD8 + (n = 112) les lymphocytes. Pour obtenir des informations de phase et d’amplitude à différents angles d’éclairage, plusieurs hologrammes 2D de chaque lymphocyte ont été mesurés en changeant l’angle d’éclairage (à partir de-60 ° c à 60 °). En règle gé…

Discussion

Nous présentons un protocole qui permet l’identification exempte d’étiquette des types de lymphocytes exploitant imagerie 3D volet quantitatif et apprentissage automatique. Les étapes critiques du présent protocole sont volet quantitatif d’imagerie et de la fonctionnalité de sélection. Pour l’imagerie holographique optimale, la densité des cellules doit être contrôlée comme décrit ci-dessus. La stabilité mécanique des cellules est aussi importante d’obtenir une répartition précise des RI 3D parce…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le KAIST BK21 + Program, Tomocube, Inc. et la National Research Foundation of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo reconnaît le soutien du KAIST présidentielle bourse et bourse de sciences biomédicales de la Fondation Asan.

Materials

Mouse Daehan Biolink C57BL/6J mice  gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tube ThermoFisher Scientific 14-959-53A 15 mL
Phosphate-buffered saline  Sigma-Aldrich 806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer  ThermoFisher Scientific A1049201
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R8758
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10438018
Antibody BD Biosciences 553140 (RRID:AB_394655) CD16/32 (clone 2.4G2)
Antibody BD Biosciences 555275 (RRID:AB_395699) CD3ε (clone 17A2)
Antibody Biolegnd 100734 (RRID:AB_2075238) CD8α (clone 53-6.7)
Antibody BD Biosciences 557655 (RRID:AB_396770) CD19 (clone 1D3)
Antibody BD Biosciences 557683 (RRID:AB_396793) CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
Antibody BD Biosciences 552878 (RRID:AB_394507) NK1.1 (clone PK136)
Antibody eBioscience 11-0041-85 (RRID:AB_464893) CD4 (clone GK1.5)
DAPI  Roche 10236276001 4,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry  BD Biosciences Aria II or III 
Imaging chamber Tomocube, Inc. TomoDish
Holotomography Tomocube, Inc. HT-1H
Holotomography imaging software Tomocube, Inc. TomoStudio
Image professing software MathWorks Matlab R2017b
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References

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Yoon, J., Jo, Y., Kim, Y. S., Yu, Y., Park, J., Lee, S., Park, W. S., Park, Y. Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning. J. Vis. Exp. (141), e58305, doi:10.3791/58305 (2018).
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