用微计算机断层扫描法对无节段3D 组织学进行固定染色、全尺寸、毫米度试样的刚性嵌入

在本手稿中, 我们提出了用于显微 CT 成像的固定和染色毫米尺度 (0.5 至 2.5 mm 直径) 试样的刚性固定的详细协议。考虑到微 CT 技术在分辨率和速度方面的迅速发展, 一种具有再成像能力的永久性样品保存方法是非常可取的。传统上, 致密的嵌入树脂通常用于电子显微镜, 以提供结构支撑, 以切割超薄截面并最大限度地减少试样的损伤。我们的方法适用于非破坏性成像过程中刚性固定的使用。为了使成像工件从过量树脂的存在中最小化, 我们实施了 X 射线透明聚酰亚胺管, 以创建无边缘的圆形样品, 并限制样品周围的树脂体积。

嵌入过程的最佳结果取决于仔细执行几个关键步骤, 并注意整个过程中的样本完整性。事实上, 破坏标本将导致最终图像被破坏, 无论成像的执行是否成功。由于冷却有助于减少疼痛反应, 而非固定组织在较高温度下降解速度更快, 因此我们使用预冷试剂。大样本可能需要被切割, 以允许固定剂进入标本内, 使内脏如肝脏, 胰腺和肠道是完全修复。不固定的组织恶化和失去结构完整性, 破坏生物结构。另一个关键的步骤是保持标本在其自然排列。因此, 我们提倡使用平底容器, 这是我们在整个过程中使用的, 在固定过程中尤为重要。在聚丙烯管或锥形管中, 通常有 V 形底部的固定应避免, 因为它们会导致细长试样弯曲, 从而扭曲试样的自然形貌。此外, 为了尽量减少树脂的使用, 聚酰亚胺管的内径仅略大于试样的宽度。试样弯曲也会导致试样进入油管时受损。还建议将标本以自然的方式转移到油管中, 以避免损伤四肢。适当的脱水是另一个关键步骤。这是通过小增量增加乙醇浓度, 以缓慢取代水与乙醇, 这是更与树脂混溶。乙醇浓度的大幅增加与组织收缩有关, 可以通过乙醇孵育的额外增量来改善, 使过渡更加渐进。最后, 为了尽量减少试样或空气袋的移动, 如果有的话, 样品在树脂聚合过程中水平放置 (4 天结束)。试样旁边的气囊或密封胶会导致光学工件与边缘衍射相关的 X 射线成像, 从而降低图像质量。

关于对该议定书可能的修改, 其他嵌入树脂和金属污渍可以代替 LR 白色丙烯酸和 PTA 分别使用。Embed812 是一种常用于电子显微镜的环氧树脂, 具有高粘性、更难转移的特性, 可能引起试样的畸变, 并与丙烯酸或乙二醇甲基丙烯酸酯树脂相比具有较高的背景。而 JB4 加, 乙二醇甲基丙烯酸酯, 比 EMbed812 粘性低, 具有较低的背景, 随机形成的气囊经常出现在附近的标本。如前所述, 空气袋降低了图像质量, 对于贵重样品尤其有问题。值得注意的是, Technovit 7100, 另一个乙二醇甲基丙烯酸酯, 干扰 PTA 染色, 导致在最终图像的对比度较差。相对地, LR 白色丙烯酸具有水样粘度, 低背景, 不干扰 PTA 染色。在我们的手中, 成功率嵌入在 LR 白色没有样品损坏或气泡是大于95%。因此, 我们提倡将其用作组织显微 CT 的嵌入树脂。在污渍方面, 在微 CT 成像中对各种金属污渍如锇四氧化二、碘和 PTA 的结果进行了比较, 并在别处讨论了^15、16、17 , 超出了这一范围。手稿。

样本大小是当前协议的一个主要限制。由于我们使用吸力将试样转移到油管中, 因此观察试样的能力对定位至关重要, 并确保它确实在油管中。因此, 像缓步动物(i. e, 水熊) 这样的亚毫米样品很难嵌入, 因为它们需要使用显微镜进行可视化。一旦吸入被应用, 显微标本很容易从焦平面丢失, 并成为挑战重新发现, 使它很难确定, 如果他们通过连接末端的油管。更大的样本, 如小鼠胚胎, (3-10 毫米) 可以嵌入对嵌入协议的细微修改 (图 4D)。特别地, 聚酰亚胺管被填充到1/3 与液态树脂, 这是在嵌入之前聚合。固定和染色样品放置在预聚合树脂的顶部。然后, 油管完全充满了未聚合树脂, 其次是第二聚合。

我们的嵌入协议的意义是多方面的。严格固定的整个动物或组织标本是可取的原因包括: (1) 创建难以生成或准备的样品的长期储存库;(2) 重新获取数据;(3) 使用多种成像方式实现串行成像;(4) 为标定和技术开发提供标准。用我们的嵌入程序制备的样品被封装在坚固的树脂中, 能够抵御损坏, 因此可以很容易地储存。长期存储对于稀有或费力生成的标本 (如与包括项目相关的样品) 特别有用。此外, 如果数字数据丢失, 则可以从原始示例生成数据。在很长一段时间内重新成像的能力可能允许在将来使用更高级的成像模式对同一样本进行审讯。由于样本在成像实例之间的物理稳定性, 图像是从同一方向的同一样本中获取的, 便于在早期和更高版本的数据集之间进行注册。例如, 低分辨率图像可能只允许在斑马鱼幼虫中进行组织分割。同样的幼虫可以在更高分辨率下重新成像, 以便在细胞分辨率上进行更详细的计算分析。这种在注册扫描之间进行直接比较的能力表明, 树脂嵌入样品是微 CT 技术发展的潜在标准。任何改变对成像方法的影响都可以通过对同一样品的成像来评估, 以便控制样品制备步骤中的所有变量。最后, 树脂嵌入的标准样品可用于仪器校准, 以测试成像的一致性。

我们以前检查突变体和病鱼组织学的工作表明, 细胞分辨率允许检测组织结构中被忽略的细微异常, 使用解剖显微镜³⁶, 或低功率立体显微镜。我们希望扩大对人体样品的高分辨率分析。斑马鱼幼虫, 包括我们的发展工作的主要主题, 是类似于人针活检在其脆弱性, 细胞和细胞间组织异质, 大小 (1-3 毫米直径), 和拉长的形状。根据我们对斑马鱼的丰富经验和其他工作表明, 微 CT 成功染色和扫描人体组织, 虽然在较低的分辨率³⁷, 我们希望我们的方法, 以增加价值的成像和分析针活检。我们估计, 组装一套足够的一个准备多达20个相同条件的样品可能少于30美元。我们的嵌入方法制备的样品具有抗物理损伤的能力, 因此易于运输。低成本和便捷的运输建议了收集来自世界各地的样本的可能性, 特别是那些没有容易接近的细胞分辨率成像与微 CT 的区域。我们的愿景是为高分辨率的针活检的数字文件 (范围从0.1 到几 tb), 以便创建人类组织的数字图谱, 同时允许研究人员细化和增强当前的分析管道, 以在扫描的组织完整的3D 环境中, 细胞和组织结构的本地化和定量表征。