임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

안구 표면에 투명 한 각 막 빛이 망막을 입력을 허용 하 고 눈의 굴절 힘의 대부분을 제공 합니다. 바깥쪽 레이어 층 화 각 막 상피를 지속적으로 limbal 상피 줄기 세포 (LESCs)에 의해 다시 생성 됩니다. LESCs corneoscleral 접속점^1,2limbal 틈새의 기저 레이어에 상주합니다. LESCs 부족 구체적이 고 독특한 마커, 그래서 그들의 식별 putative 마커 집합의 더 광범위 한 분석을 요구 한다. 상피 녹음 방송 요인 p63, 및 특히 N 말기 잘린 p63의 알파 isoform의 (ΔNp63α), 관련 긍정적인 LESC 마커^3,4으로 제안 되었습니다. LESCs의 비대칭과 자기 갱신, 하지만 또한 centripetally 및 anteriorly 마이그레이션하는 자손을 생산 수 있습니다. 세포 막 표면으로 진행 그들은 점차적으로 그들의 stemness 잃게 되 고 마지막으로 지속적으로 각 막 표면에서 손실 표면 편평 세포에 분화 말기.

각 막 층의 손상이 심각한 시각 장애, 이어질 수 있습니다 그리고 각 막 결함은 이렇게 전세계 시각 손실의 주요 원인 중 하나. Limbal 줄기 세포 결핍 (LSCD)는 limbus 질병 또는 conjunctivalization, 비전^5,6의 후속 손실과 각 막 표면의 opacification 외상에 의해 소멸 됩니다. 세포 대체 요법 사용 헌 또는 수용자 limbal 이식 LSCD^4,7,,89환자에 대 한 치료 전략을 제공 합니다. 그러나, 그리고 건강 한 눈에 합병증의 위험 곰 수확 자가 이식 기증자 조직 공급 부족 이다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 특히 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 임상 관련 종류의 세포, 각 막 상피 세포를 포함 하 여 무제한 원천이 될 수 있습니다. 따라서, hPSC에서 파생 된 LESCs (hPSC-LESCs) 안구 세포 대체 요법에 대 한 매력적인 새로운 셀 소스를 나타냅니다.

전통적으로, undifferentiated hPSC 문화 메서드 및 LESCs 그들의 분화 프로토콜 정의 되지 않은 피더 세포, 동물 세라, 바른된 미디어 또는 양수 막^10,11, 의 사용에 의존 해야 ^{12 , 13 , 14 , 15}. 최근, 노력 더 안전한 세포 치료 제품으로 표준화 하 고 이종 문화 및 분화 프로토콜에 대 한 검색 하 라는 메시지가 있다. 그 결과, undifferentiated hPSCs의 장기 문화에 대 한 여러 가지 정의 및 이종 무료 방법을 상용^16,,1718지금 있다. 연속체, 각 막 상피 운명에 hPSCs 가이드 분자 신호에 의존 하는 프로토콜은 최근 되었습니다 감독된 차별화 도입^{19,20,,2122, 23}. 아직 이러한 프로토콜의 많은 소재, 또는 차별화에 대 한 복잡 한, xenogeneic 증가율 칵테일을 시작으로 중 정의 되지 않은, 피더 기반으로 hPSCs를 사용.

이 프로토콜의 목적은 제공 하는 강력 하 고, 최적화, 이종 하-급지대 무료 hPSC 문화 방법 및 각 막 LESCs에 후속 차별화. 단층 문화 정의 알 부 민 무료 hPSC 매체 (특히 필수 8 플렉스)에 laminin-521 (LN-521) 매트릭스에 만능 hPSCs의 차별점에 대 한 균질 시작 물자의 급속 한 생산을 허용 한다. 그 후, 간단한 2 단계 차별화 전략 hPSCs 서 스 펜 션, 부착 차별화 LESCs 뒤에 표면 ectodermal 운명 향해 가이드. 24 일 이내 > 65% ΔNp63α를 표현 하는 세포 인구를 얻을 수 있습니다. Xeno 급지대 무료 프로토콜 셀 라인 특정 최적화에 대 한 어떤 요구 든 지 없이 여러 hPSC 라인 (hESCs 및 hiPSCs), 테스트 되었습니다. 주말 무료 유지 보수, 뿌리고, cryostoring 및 hPSC LESC 형질 여기 설명에 대 한 프로토콜 사용에 대 한 높은-품질 LESCs의 큰 배치의 생산 임상 또는 연구 목적.