Summary

Medição de hipofaringe glândula Acinus tamanho em trabalhadores de abelhas (Apis mellifera)

Published: September 14, 2018
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Summary

Hipofaringe glândula acinus tamanho é uma medida robusta de nutrição de abelhas de mel de enfermeira. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para dissecar, coloração, imagem e medição ácinos de glândula enfermeira abelha hipofaringe.

Abstract

As enfermeira hipofaringe glândulas produzem a fração proteica do trabalhador e geleia real que é alimentada para desenvolver as larvas e as rainhas. Estas glândulas pareadas localizadas na cabeça da abelha são altamente sensíveis à quantidade e qualidade de pólen e pólen substitutos que a enfermeira abelha consome. As glândulas ficam menores quando as enfermeiras são alimentadas com dietas deficientes e são grandes, quando eles são alimentados com dietas completas. Porque a enfermeira hipofaringe glândula tamanho é um indicador robusto da enfermeira nutrição, é essencial que os que estudam a nutrição de abelhas de mel sabem como medir essas glândulas. Aqui, nós fornecemos métodos detalhados para dissecando, coloração, imagem latente e glândulas de hipofaringe enfermeira abelha de medição. Apresentamos as comparações de dados que foram usados para estudar o impacto do pólen no tamanho da glândula e tecido imaculado e manchado. Este método tem sido usado para testar como dieta afeta o tamanho de glândula de hipofaringe, mas tem mais uso para compreender o papel dessas glândulas na saúde de colmeia.

Introduction

As abelhas são essenciais para a agricultura porque eles polinizam uma variedade de culturas que são consumidos por seres humanos e animais. Muita atenção para o declínio das populações de abelhas de mel como focalizar de perdas de colônia em torno de 30-40% anualmente no Estados Unidos1 e 10-15% na Europa,2,3. Múltiplos fatores, incluindo o acesso reduzido a alta qualidade de forragem, provável ato juntos para afetar negativamente a saúde das abelhas de mel. Monocultura, seca, práticas insustentáveis de apicultura e outros fatores diminuem a diversidade e a quantidade de pólens naturais disponíveis para colônias4,5. Porque as abelhas derivam quase todas as suas proteínas dietéticas e lipídios de pólen, acesso reduzido ao pólen pode limitar severamente a saúde individual e colônia.

As glândulas de hipofaringe são estruturas secretoras, localizadas na cabeça da abelha, entre os olhos e o cérebro6. Em circunstâncias normais, a trajetória do desenvolvimento e funcional das glândulas espelho que da abelha estão localizados no. Com aproximadamente 5-10 dias de idade, a abelha realiza comportamentos de enfermagem na colmeia. Neste mesmo momento, as glândulas de hipofaringe atingir seu pico e capacidade secretora, produzindo a fração de proteína principal do alimento ninhado ou geleia alimentado para o desenvolvimento de larvas e outros adultos, como a rainha. Neste tamanho de pico as glândulas se assemelhar a um cacho de uvas, onde cada uva é uma estrutura discreta lobo conhecida como o acinus (plural: acinar). Como a abelha operária, idades e assume diferentes tarefas na colmeia, as glândulas de hipofaringe encolhem e assumem diferentes funções, como quebrar açúcares no néctar7,8. As glândulas de hipofaringe, portanto, estão correlacionadas com a idade da abelha e sua tarefa associada a idade.

Tamanho de glândula enfermeira hipofaringe é sensível à quantidade e qualidade de proteína em sua dieta9,10,11. Quando a enfermeira abelhas são bem nutridas, suas glândulas são grandes. Considerando que, as glândulas são pequenas quando a abelha é privada de pólen, particularmente na primeira semana do desenvolvimento adulto. Para determinar o estado nutricional de uma abelha de enfermeira, pesquisadores normalmente medem as glândulas de hipofaringe, ou medindo diretamente a glândula acinus tamanho11,12,13,14 ou proteína15,16 de conteúdo ou medindo-se a proteína11 de conteúdo ou peso fresco17 de cabeça inteira onde eles estão localizados. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens. Nós preferimos a resolução Obtida de medição ácinos da glândula, embora esse método pode ser um desafio de duas maneiras principais. O primeiro desafio é identificar e dissecar a glândula corretamente. O segundo é a obtenção de uma medida exata de cada acinus. Sob um microscópio de luz dissecação, as glândulas aparecem transparente ou leitoso branco e as fronteiras dos ácinos podem ser difícil de definir. Ter ferramentas para definir melhor a borda da acinar e aumentar a probabilidade de obter medições precisas da glândula é benéfica a ninguém estudar nutrição de abelha de mel.

Aqui, nós mostramos pesquisadores interessados como dissecar, mancha, imagem e medir a hipofaringe glândulas para que as medidas exatas de tamanho acinus podem ser alcançadas. O método que descrevemos oferece pesquisadores um método fácil, preciso e replicável para alcançar várias medições de glândula em um período relativamente curto de tempo, uma vez que o experimentador é suficientemente praticado. Um com confiança poderia medir as glândulas de quase 10 pessoas em mais de uma hora. Oferecemos detalhes sobre o método e materiais necessários para obter estas medidas. Os aspectos mais importantes dos métodos indicados abaixo são a dissecação adequada e coloração das glândulas. Apesar de capturar as imagens ampliadas e medir os ácinos com software comercial, os métodos que apresentamos podem ser facilmente adaptados para outras plataformas,18.

Protocol

1. dissecando e manchando as glândulas de hipofaringe de trabalhadores de enfermeira Fazer uma placa de dissecação de cera derretendo cera de definição legal em uma pequena (60 mm x 15 mm) ou um copo grande (100 x 15 mm) placa de Petri. Esfrie a cera completamente antes de usar a placa para as dissecções. Para cada abelha para serem processados, prepare-se 20 µ l de uma 01:20 Giemsa solução de trabalho (01:20 v/v de preparado o corante de Giemsa em tampão fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2…

Representative Results

Glândulas de hipofaringe foram dissecadas da enfermeira trabalhadores e visualizadas com e sem mancha na ampliação de 60 – 80 X (Figura 1). No tecido imaculado, é difícil encontrar o contraste adequado totalmente foco e definir as bordas dos ácinos. No tecido manchado, as bordas dos ácinos são nítidas devido o melhor contraste entre o tecido manchado e o fundo branco. <img alt="Figure 1" …

Discussion

Tamanho de glândula de hipofaringe é sensível à quantidade de proteína e pólen na dieta e um marcador crítico de nutrição em abelhas adultas jovens. Aqui, vamos demonstrar uma maneira barata e reprodutível para dissecar e medir este tecido. Estes tecidos podem ser difíceis de dissecar, mas com a prática, um pode obter cada vez mais limpas dissecações com o tecido relativamente intacta. A principal vantagem do método apresentado aqui é que o tecido é manchado, o que permite que o pesquisador Visualizar cl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por fundos internos a partir do USDA-ARS (número do projeto: 2022-21000-017-00-D). O USDA/ARS é um empregador que oferece oportunidades iguais e provedor.

Materials

Cool setting wax Grobet USA 21.450
Glass petri dish, small VWR 89000-310
Glass petri dish, large VWR 89000-314
Super Max Wax Pen Eurotool PEN-520.00
Breakable razor blades Electron Microscopy Sciences 72004
pin vise BioQuip 4845
2A-SA flat/rounded tip forceps Rubis/BioQuip 4522
Fine point forceps Rubis/BioQuip 4523
5A-SA super fine point forceps Rubis/BioQuip 4525
10 mm micro spring scissors BioQuip 4715
3 mm micro spring Vannas scissors Roboz RS-5610
Glass Depression Slides, Single Cavity GSC International 4-13057-DZ-12
PBS tablets VWR 97062-730
Giemsa stain, modified solution Sigma Aldrich 32884
Insect pins ENTO SPHINX S.R.O. 02.02
Leica Applications Suite measurement software Leica Microsystems any measurement software, including free software, can be used

References

  1. Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
  2. Jacques, A., et al. A pan-European epidemiological study reveals honey bee colony survival depends on beekeeper education and disease control. PLoS One. 12 (3), e0172591 (2017).
  3. Zee, R. v. d., et al. Results of international standardised beekeeper surveys of colony losses for winter 2012-2013: analysis of winter loss rates and mixed effects modelling of risk factors for winter loss. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 19-34 (2014).
  4. Decourtye, A., Mader, E., Desneux, N. Landscape enhancement of floral resources for honey bees in agro-ecosystems. Apidologie. 41 (3), 264-277 (2010).
  5. Vaudo, A. D., Tooker, J. F., Grozinger, C. M., Patch, H. M. Bee nutrition and floral resource restoration. Current Opinion in Insect Science. 10, 133-141 (2015).
  6. Snodgrass, R. E. . Anatomy of the Honey Bee. , (1984).
  7. Winston, M. L. . The Biology of the Honey Bee. , (1987).
  8. Johnson, B. R. Division of labor in honeybees: form, function, and proximate mechanisms. Behavioral Ecology and Sociobiology. 64 (3), 305-316 (2010).
  9. Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1989).
  10. Pernal, S. F., Currie, R. W. Pollen quality of fresh and 1-year-old single pollen diets for worker honey bees (Apis mellifera L). Apidologie. 31 (3), 387-409 (2000).
  11. DeGrandi-Hoffman, G., Chen, Y., Huang, E., Huang, M. H. The effect of diet on protein concentration, hypopharyngeal gland development and virus load in worker honey bees (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 56 (9), 1184-1191 (2010).
  12. Corby-Harris, V., Snyder, L., Meador, C., Ayotte, T. Honey bee (Apis mellifera) nurses do not consume pollens based on their nutritional quality. PLoS One. 13 (1), e0191050 (2018).
  13. Corby-Harris, V., et al. Transcriptional, translational, and physiological signatures of undernourished honey bees (Apis mellifera) suggest a role for hormonal factors in hypopharyngeal gland degradation. Journal of Insect Physiology. 85, 65-75 (2016).
  14. Corby-Harris, V., Jones, B. M., Walton, A., Schwan, M. R., Anderson, K. E. Transcriptional markers of sub-optimal nutrition in developing Apis mellifera nurse workers. BMC Genomics. 15, 134 (2014).
  15. Sagili, R. R., Pankiw, T., Zhu-Salzman, K. Effects of soybean trypsin inhibitor on hypopharyngeal gland protein content, total midgut protease activity and survival of the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Insect Physiology. 51 (9), 953-957 (2005).
  16. Sagili, R. R., Pankiw, T. Effects of protein-constrained brood food on honey bee (Apis mellifera L.) pollen foraging and colony growth. Behavioral Ecology and Sociobiology. 61 (9), 1471-1478 (2007).
  17. Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671 (2012).
  19. Jack, C. J., Uppala, S. S., Lucas, H. M., Sagili, R. R. Effects of pollen dilution on infection of Nosema ceranae in honey bees. Journal of Insect Physiology. 87, 12-19 (2016).
  20. Crailsheim, K. The protein balance of the honey bee worker. Apidologie. 21, 417-429 (1990).

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Cite This Article
Corby-Harris, V., Snyder, L. A. Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers. J. Vis. Exp. (139), e58261, doi:10.3791/58261 (2018).

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