낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

1. 세포 감염 및 DNA 추출 교양된 Huh7-NTCP 셀8,9 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 그리고 2 m L-글루타민 m x 1와 보완을 유지 합니다.참고: 이것은 이전 알려졌다 세부40에. 시드 2 x 105 셀/mL Huh7 NTCP 셀 DMEM 1 mL와 함께 12-잘 접시로. 세포 치료 (예를 들어, HBV 억제제)를 테스트 하는 경우 적용할 표면에 뜨는 문화에 4 h 시드 (1 일 HBV 감염이 이전) 후. 음수는 컨트롤에 대 한 적용 200 nM Myrcludex B (는 강력한 HBV 항목 억제제41). 1000 VGE/셀 문화 미디어 (DMEM 보충 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 2 m L-글루타민, m 및 2.5 %v / v x 1의 500 µ L에서 세포를 감염 하는 inoculum HepAD3843 에서 헤 파 린-열 순화42 상쾌한 사용 DMSO) [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 녹아] 4 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 8000에 포함 된. (5% CO2 와 90% 습도 설정) 37 ° C 배양 기에서 세포 문화. 16-24 h 감염 된 후에 살 균 1 x PBS의 1 mL로 두 번 셀을 씻어. 문화 미디어 수확까지 HBV 감염을 따르는 2 일 마다 교체 합니다. 감염 된 후 3 일에서 5 µ M 테 노와 10 µ M 세포 치료 Lamivudine invPCR에 의해 amplifiable는 HBV 일차 중간체의 생산 제한. 감염 된 5 일 후, 트립 신-EDTA의 200 µ L 셀 trypsinize과 DMEM (보충 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 그리고 2 m L-글루타민 m x 1), 또한 포함 하는 5 µ M 테 노와 10 µ M의 2 ml resuspend Lamivudine입니다. (어떤 보고 되었습니다 HBV cccDNA44 와 amplifiable는 다른 HBV DNA 중간체의 손실을 유도 하 여 invPCR) 유사 분열의 한 라운드를 유도 하기 위해 6 잘 플레이트 세포 정지를 전송 합니다. 7 일 감염 된 후, 트립 신-EDTA의 400 µ L에 확장된 셀 trypsinize 고 DMEM 1 mL에 혼합물을 resuspend. 1.5 mL 튜브에 정지를 배치 하 고 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 포부에 의해는 상쾌한을 제거 합니다. (선택 사항) 그들은 DNA 추출에 대 한 준비가 될 때까지-20 ° C에서 셀 펠 릿을 저장 합니다. 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 DNA를 추출 합니다. 광학 densitometry를 사용 하 여 최종 DNA 농도 견적 한다.참고: 100 μ 차입 볼륨에서 DNA 수율은 일반적으로 250 ~ 400 ng/μ. 2입니다. DNA의 반전 총 DNA의 aliquot ~1.5–2.5 μ g 200 μ PCR 튜브에 1 단계에서 추출 합니다. 금지 효소 소화 반응 버퍼 x 1을 포함 하는 40 μ 반응 볼륨을 마스터-믹스의 적절 한 금액을 추가 (예., CutSmart 버퍼)와 10 U Nco난-HF. 반응을 철저 하 게 혼합 하 고 작은 튜브 원심 분리기에 아래로 회전. 제한 효소 반응이 최적의 소화 효율에 대 한 1 시간에 대 한 37 ° C에서 PCR 기계에 품 어. 20 분 동안 80 ° C에서 배양 하 여 제한 효소 비활성화. 1.5 mL 튜브에 대 한 전체 제한 효소 반응 전송. T4 DNA 리가 버퍼와 500 U의 T4 DNA 리가 x 1의 400 μ를 추가 하 고 그것을 철저 하 게 혼합. 큰 반응 볼륨 소화 DNA 파편의 내부 분자 (분자 간) 반대 결 찰을 권장합니다. 결 찰 반응 완전 결 찰 되도록 2 시간 실 온에서 품 어. 20 분 동안 70 ° C에서 T4 DNA 리가 비활성화 T4 리가의 완전 한 비활성화 되도록 10 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염의 10 μ를 추가 합니다. 펄스 vortexing에 의해 튜브를 혼합 하 고 짧게 반응 혼합 아래로 회전. 90 µ g/mL의 최종 농도를 100 m m와 dextran (35-45 kDa)의 최종 농도에 NaCl을 추가 합니다. 펄스 vortexing에 의해 튜브를 혼합 하 고 짧게 반응 혼합 아래로 회전. 반전에 의해 100% 에탄올과 혼합의 900 μ를 추가 합니다. 하룻밤-20 ° C에서 DNA를 침전. 펠 렛 15 분 14000 x g에서 원심 분리 하 여 침전 된 DNA P200 피 펫과 포부는 상쾌한을 제거 합니다. 14000 x g 15 분 동안에 70 %v / v 에탄올과 원심 분리의 500 μ와 펠 릿을 세척. P200 피 펫과 포부에 의해 에탄올을 제거 합니다. 20 분 동안 실 온에서 DNA 펠 릿 건조 분해 소화 반응 버퍼 x 1, 5 U BsiHKAI의 그리고 5 U Sph-HF. 품 40 μ 반응 볼륨을 제한 효소 마스터 믹스의 H2o. 추가 20 μ의 20 μ에 펠 릿에서 제한 효소 반응 한 열-블록 37 ° C ( SphHF에 대 한 최적의 온도) 1 시간에서. 짧게 반응 혼합 아래로 회전 합니다. 65 ° C ( BsiHKAI에 대 한 최적의 온도) 1 h에서 열 블록에 제한 효소 반응을 품 어. 짧게 반응 혼합 아래로 회전 합니다. 다음 단계까지-20 ° C에서 거꾸로 DNA를 저장 합니다. 3. 중첩 된 PCR DNA 저하 솔루션을 사용 하 여 재사용 가능한 실리콘 매트 봉인에서 잠재적인 amplicons를 제거 하 고 매트 DNA 무료 물으로 깨끗이 씻어 PCR 혼합물을 준비 하는 동안 실 온에서 건조. 외부 앞으로 포함 하는 1 x PCR 믹스의 1 mL를 준비 (5′-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3′)와 역 (5′-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3′) 0.5 µ M의 농도에서 뇌관. 웰 스 a 1과 E1 PCR 96 잘 접시에 170 μ 1 x PCR 믹스를 추가 합니다. 웰 스 B1 H1 120 μ 1 x PCR 믹스를 추가 합니다. 단계 2에서에서 a 1과 E1 웰 스 거꾸로 dna 10 μ를 추가 (2 다른 거꾸로 샘플 같은 PCR 접시에 분석 될 수 있다). 믹스에 각각 약 10 배를 부드럽게 pipetting으로 각 잘 반응 사용 P1000 100 μ로 설정 하 여. 순차적으로 희석 샘플에서 각 단계에서 60 μ를 전송 하 여 1: 3의 비율로 a 1 D1 우물. 부드럽게 10 번 사용 하 여 100 μ로 설정 P1000 pipetting으로 각 단계에서 우물을 믹스. 거품을 형성 하지 마십시오. 잘 H1 아래로 diluting 잘 E1 단계 3.6를 반복 합니다. 사용 하 여 다중 채널 피 펫 웰 스 A2-H2, H3 a 3에 우물 A1-H1 등 96 잘 접시의 우물 A12 H12 도달까지 반응 혼합물의 aliquot 10 μ. 단계의 3.1, 단단히 눌러 건조 실리콘 매트 PCR 플레이트 커버. PCR 기계에 접시를 놓고 다음 프로그램 실행: 95 ° C에서 10 분 15의 35 주기 95 ° C, 15에서 s s 54 ° C 및 72 ° C에서 3 분에서 72 ° C에서 7 분 그런 다음 실 온에서 접시를 개최. 분 젠 버너와 고온에 96 핀 복제기의 핀 열 하 고 실 온에서 적어도 5 분 동안 쿨. 10 μ 1 x PCR 혼합 (젤 로드 준비 버퍼 포함)와 내 면 앞으로의 두 번째 PCR 접시의 우물을 채워 (5′-CGC ATG 개 그 ACC ACC GTG A-3′)와 역 (5′-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3′)에서 0.5 µ M. 조심 스럽게 라운드 PCR 96 잘 접시의 PCR 접시에서 실리콘 매트를 제거 하 고 우물 사이의 교차 오염을 방지. 냉각된 복제기를 사용 하 여 새로 aliquoted 96 잘 접시에 1 라운드 PCR에서 96 잘 접시의 PCR 제품을 전송. 초기 변성 단계 95 ° C에서 10 분에서 2 분으로 변경 제외한 3.8, 단계 에서처럼 동일한 조건을 사용 하 여 중첩 된 PCR을 실시 합니다. 4. PCR 제품 고립과 젤 추출 1.3 %w / v agarose 젤 96-잘 사용 하는 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품을 분석. 100 mL agarose 젤에 대 한 10-15 분에 대 한 200 V에서 실행 합니다. 일회용 마시는 빨 대를 사용 하 여 agarose 젤에서 DNA 밴드 삭제하시오 각 PCR 제품에 대 한 빨 대 놓고 agarose 젤 1.5 mL 튜브에 연결 하 고가 위로 빨 대 크기를 손질 합니다.참고: 단일 PCR 제품 해결 될 수 있는 그 희석 에서만에서 밴드 분리 충분 하다. (선택 사항) -20 ° C 이상 추출에서 튜브를 저장 합니다. 밀 짚 조각의 끝에 당기고 하 여 각 관으로 agarose 플러그를 꺼냅니다. 각 튜브를 젤 추출 버퍼의 300 μ와 젤 추출 유리 구슬 슬러리의 5 μ를 추가 합니다. (를 제외 하 고 세척 단계에 대 한 반-볼륨을 사용 하 여) 젤 추출 키트에 대 한 제조업체의 지침에 따라 PCR 제품을 추출 하 고 물 30 μ와 구슬에서 DNA elute. 생어 순화 된 DNA 제출 두 번째 라운드에서 사용 하는 앞으로 뇌관 (공급 업체의 지침)에 따라 시퀀싱 중첩 PCR. 5. 시퀀스 분석 뉴클레오티드 폭발 분석 (를 사용 하 여 전체 뉴클레오티드 컬렉션을 정렬 하는 기본 설정)를 수행 하 여 바이러스 세포 DNA 연결을 확인 합니다.참고: 대표적인 결과 그림 3 아래에 자세히 나와 있습니다. 시퀀스의 부분 정렬, 관찰 하는 경우에 잘라 5′ HBV DNA 시퀀스 다시 폭발 분석을 실행 하기 전에. 지정 된 시퀀스 나타냅니다 다음과 같이 진정한 통합 접점 확인 하 엄격한 선택 기준 적용: 포함 된 시퀀스가 포함 > 20 세포 게놈을 확신 매핑 위한 셀룰러 시퀀스의 혈압. 10 가정된 바이러스-세포 통합 교차점, 그들은 가능성이 대표 체 외에서 결 찰 이벤트의 혈압 보다 진정한 통합 연결 내에서 사용 하는 모든 효소의 금지 사이트를 포함 하는 모든 시퀀스를 무시 했다. 이들은 연속 반응 동안 교차 오염에 의해 생성 된 가능성이 유물으로 시퀀싱 chromatographs에 가정된 통합 접합의 양쪽에 명백한 비슷하지 피크 형광 수준으로 어떤 시퀀스를 무시 하거나 모 세관 착 색 인쇄기입니다. 그 정확한 HBV와 바이러스 세포에 세포 시퀀스 고유한 통합 이벤트를 정의 합니다.참고: 고유한 통합 이벤트의 반복 (부정적인 제어 반응, 대표적인 결과에 설명 추가 사용 하 여 시험 될 수 있는 PCR 동안 그 통합 또는 교차 오염을 포함 된 셀의 클론 확장에서 발생할 수 있습니다. 아래 참조). 특정 세포 시퀀스에 반복된 통합 비 동종 최종 가입 경로 사용된15각 통합 이벤트에 대 한 다른 HBV 터미널 사이트를 표시 하려면 예상 된다. 통합 주파수 정규화 총 DNA 입력 양을 반전 반응으로 다음 그 희석에서 바이러스-셀 연결의 수에 의해 거꾸로 DNA 템플렛의 희석 비율을 곱하여 계산 합니다. 일반적으로, 통합 주파수 1시 10분의 순서는4 셀.