זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

1. תא זיהום והפקת דנ א לשמור על תרבות Huh7-NTCP תאים8,9 בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 10% v/v עוברית שור סרום, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, ו- 2 מ מגלוטמין.הערה: זה בעבר דווח בפירוט40. זרע 2 x 105 תאים למ”ל Huh7-NTCP תאים לתוך צלחת 12-ובכן עם 1 מ”ל של DMEM. אם בדיקות תא טיפולים (למשל, מעכבי HBV), להחיל אותם על התרבות supernatant 4 שעות לאחר זריעה (יום 1 לפני HBV זיהום). עבור פקד שלילי, להחיל 200 ננומטר Myrcludex B (עוצמה HBV כניסה מעכב41). להשתמש הפארין עמודות טיהור42 תגובת שיקוע HepAD3843 inoculum כדי להדביק תאים על 1,000 VGE תא ב- 500 µL של תרבות התקשורת (DMEM בתוספת 10% v/v סרום שור עוברית, 1 x v/v פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין ו- 2.5% דימתיל סולפוקסיד), המכיל 4% w/v פוליאתילן גליקול 8000 [מומס 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)]. התרבות התאים חממה 37 ° C (מוגדר ב- 5% CO2 ו- 90% לחות). לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ”ל של PBS עקר 1 x ב- 16-24 שעות לאחר הפגיעה. החלף את המדיה תרבות כל יומיים בעקבות זיהום HBV עד הקציר. -יום 3 לאחר הפגיעה, מתייחסים התאים עם 5 מיקרומטר Tenofovir disoproxil ו- 10 מיקרומטר Lamivudine להגביל את הייצור של HBV intermediates replicative כי הם amplifiable על ידי invPCR. יום 5 לאחר הפגיעה, trypsinize את התאים עם 200 µL של טריפסין-EDTA, resuspend אותם ב 2 מ של DMEM (בתוספת 10% v/v סרום שור עוברית, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, ו- 2 מ מגלוטמין), המכיל גם 5 מיקרומטר Tenofovir disoproxil ו- 10 מיקרומטר Lamivudine. להעביר את המתלים תא צלחת 6-ובכן לזירוז סיבוב אחד של מיטוזה (אשר דווחה כדי לגרום לאובדן של HBV cccDNA44 , אחרים intermediates HBV DNA כי הם amplifiable על-ידי invPCR). יום 7 לאחר הפגיעה, trypsinize בתאים µL 400 של טריפסין-EDTA המורחב, resuspend התערובת של 1 מ”ל של DMEM. למקם את המתלים צינור 1.5 mL הצניפה התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 g x במשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה. (אופציונלי) אחסן את כדורי תא ב-20 ° C עד שיהיו מוכנים להפקת DNA. לחלץ את ה-DNA מ בגדר התא באמצעות ערכת חילוץ דנ א, לפי הוראות היצרן. מעריכים את ריכוז הדנ א הסופי באמצעות densitometry אופטי.הערה: התשואה DNA באמצעי אחסון • תנאי 100 μL בדרך כלל ~ 250-400 ng/μL. 2. היפוך של דנ א Aliquot ~1.5–2.5 μg של ה-DNA הכולל לחלץ משלב 1 לתוך צינור PCR μL 200. להוסיף את הכמות המתאימה של אנזים הגבלה מאסטר-מיקס את התוצאה אמצעי תגובה 40 μL המכיל 1 x תקציר התגובה מאגר (למשל., מאגר CutSmart) ו- 10 U המשאני-HF. לערבב את התגובות ביסודיות, ספין למטה ומפרידה צינורית קטנה. דגירה התגובה אנזים הגבלה במכונת ה-PCR ב 37 ° C עבור h 1 ליעילות לעיכול אופטימלי. בטל את אנזים הגבלה על-ידי המקננת ב 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. להעביר את התגובה אנזים הגבלה כל צינור 1.5 מ. מוסיפים μL 400 1-T4 DNA ליגאז מאגר ו- 500 U של T4 DNA ליגאז ומערבבים אותו ביסודיות. האחסון תגובת גדולה מעודדת אינטרה-מולקולרית (להבדיל בין-מולקולריים) מצדו של שברי DNA מעוכל. דגירה התגובה מצדו בטמפרטורת החדר במשך שעתיים להבטיח מצדו מלאה. בטל את T4 DNA ליגאז ב 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. להוסיף 10 μL של 10% w/v dodecyl סולפט נתרן כדי להבטיח איון מוחלט של ליגאז T4. לערבב את הצינורות על ידי הדופק vortexing, בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. להוסיף NaCl ריכוז סופי של 100 מ מ, לתוספי (35-45 kDa) כדי ריכוז סופי של 90 µg/mL. לערבב את הצינורות על ידי הדופק vortexing, בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. הוסף 900 μL של 100% אתנול וביו -מיקס על ידי היפוך. לזרז את ה-DNA ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צניפה הדנ א precipitated על ידי צנטריפוגה-14,000 g x עבור 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע על ידי השאיפה עם פיפטה P200. לשטוף את גלולה עם 500 μL של 70% v/v אתנול וביו -צנטריפוגה ב g x 14,000 למשך 15 דקות. הסר האתנול על ידי השאיפה עם פיפטה P200. מילה נהדרת בגדר DNA בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. להמיס בגדר ב 20 μL של H2O. להוסיף 20 μL של אנזים הגבלה מאסטר-שילוב את התוצאה אמצעי תגובה 40 μL המכיל 1 x תקציר התגובה מאגר, 5 U של BsiHKAI ו-5 U של Sph-HF. Incubate התגובה אנזים הגבלה ב חום-רחוב 37 ° C (טמפרטורה אופטימלית עבור Sph-HF) לשעה. בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. דגירה התגובה אנזים הגבלה בתוך גוש חום-65 ° צ’ (טמפרטורה אופטימלית עבור BsiHKAI) לשעה. בקצרה ספין למטה תערובת התגובה. חנות ה-DNA הופכיים ב-20 ° C עד השלב הבא. 3. שרשור PCR להסיר amplicons פוטנציאליים גושפנקה mat סיליקון לשימוש חוזר באמצעות פתרון השפלה דנ א, לשטוף את השטיח ביסודיות עם מים ללא ה-DNA, מילה נהדרת זה בטמפרטורת החדר תוך כדי הכנת התערובת PCR. להכין 1 מ”ל של תערובת x PCR 1 המכיל פארווערטס החיצוני (5′-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3′), הפוכה (5′-AAA לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה מס רווחי הון CCC GCG חטיבתי-3′) תחל בריכוז של 0.5 מיקרומטר. להוסיף μL 170 של המיקס x PCR 1 בארות A1 ו- E1 לתוך צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 120 μL של המיקס x PCR 1 בארות B1 ל H1. להוסיף 10 μL של ה-DNA הופכיים משלב 2 בארות A1 ו- E1 (2 דוגמאות ההפוכה שונות ניתן לנתח באותה צלחת PCR). לערבב התגובה לכל היטב על ידי בעדינות pipetting כל אחד 10 פעמים משתמש של P1000 מוגדר כ- 100 μL. באופן סדרתי שתדללו דגימות בארות A1 כדי D1 ביחס של 1:3 על ידי העברת μL 60 בכל שלב. לערבב את הבארות בכל שלב על ידי בעדינות pipetting אותם על פי 10 השימוש של P1000 מוגדר כ- 100 μL. הימנע ויוצרים בועות. חזור על שלב 3.6 עבור טוב E1, דילול ל H1 היטב. ΜL 10 aliquot של תערובת התגובה באמצעות פיפטה רב ערוצית של בארות A1-H1 לתוך בארות A2-H2, A3-H3, וכן הלאה עד שהגיע בארות A12-H12 של צלחת 96-ובכן. מכסים את הצלחת ה-PCR עם המשטח יבש סיליקון מהשלב 3.1, כשאגיד. מקם את הצלחת במכונת ה-PCR ולהפעיל את התוכנית הבאה: 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 35 מחזורי 15 s ב 95 ° C, 15 s ב 54 ° C ו 3 דקות ב-72 מעלות; 7 דקות ב-72 מעלות; . אז, להחזיק את הצלחת בטמפרטורת החדר. מחממים את הסיכות של משכפל 96-pin כדי לוהט עם מבער בונזן, ואז להתקרר למשך לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר. למלא הבארות של צלחת PCR השנייה עם μL 10 של תערובת x PCR 1 (מכיל מאגר עומס-מוכנות ג’ל), פארווערטס הפנימי (5′-CGC ATG איסור פרסום ACC ACC חברתנו A-3′), הפוכה (5′-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3′) ב- 0.5 מיקרומטר. בזהירות להסיר הצלחת ה-PCR של צלחת 96-ובכן מ- PCR בסיבוב הראשון שטיח סיליקון, ולהימנע זיהום צולב בין בארות. השתמש המשכפלים מקורר להעביר את המוצרים ה-PCR של צלחת 96-ובכן מ- PCR בסיבוב הראשון לצלחת 96-ובכן aliquoted לאחרונה. לבצע את ה-PCR המקונן משתמש באותם התנאים כמו שלב 3.8, למעט שינוי השלב הראשוני דנטורציה ב 95 ° C מ- 10 דקות ל- 2 דקות. 4. PCR מוצר בידוד והפקת ג’ל לנתח את המוצרים PCR על-ידי שימוש 96-ובכן עם 1.3% w/v agarose ג’ל אלקטרופורזה בג’ל. עבור agarose 100 מ ל ג’ל, הפעל ב- 200 וולט למשך 10-15 דקות. בלו הלהקות דנ א ג agarose באמצעות קשיות שתייה חד פעמיות. עבור כל מוצר ה-PCR, למקם את הקש, agarose ג’ל לחבר צינור 1.5 mL ולחיתוך הקש לגודל עם מספריים.הערה: זה מספיק כדי לבודד להקות רק מפני דילולים האלה שבהם ניתן לפתור מוצרי ה-PCR יחיד. (אופציונלי) אחסן את הצינורות ב-20 ° C לחילוץ מאוחר יותר. הוצאת השתלים agarose לתוך כל שפופרת לוחצת על הסוף של השבר קש. להוסיף 300 μL ג’ל החילוץ מאגר ו μL 5 של ג’ל החילוץ זכוכית חרוז slurry כל שפופרת. לחלץ את המוצרים PCR לפי הוראות היצרן עבור ערכת חילוץ ג’ל (למעט שימוש חצי-אמצעי אחסון לכביסה צעדים), elute את ה-DNA של החרוזים עם 30 μL של מים. שלח את ה-DNA מטוהרים עבור סנגר רצף (לפי ההוראות של הספק) עם פריימר לפנים המשמשים את הסיבוב השני מקונן PCR. 5. רצף ניתוח לאשר תאים וירוס DNA צמתים על ידי ביצוע ניתוח הפיצוץ נוקלאוטיד (באמצעות הגדרות ברירת המחדל של יישור לאוסף נוקלאוטיד כולו).הערה: תוצאות ייצוגית מפורטים איור 3 להלן. אם רק יישור חלקי של הרצף נצפית, לקצץ את 5′ HBV DNA רצף לפני הפעלה מחדש ניתוח הפיצוץ. החלת קריטריוני הבחירה מחמירים כדי לקבוע אם רצף נתון מייצג שילוב נכון צומת כדלקמן: כוללים רק רצפים המכיל > 20 bp של רצף הסלולר עבור בטוח מיפוי הגנום הסלולר. להתעלם כל רצפי המכילים הגבלת אתרים של כל אנזימים שמוצעת 10 bp של הצומת שילוב תאים וירוס אמור, כפי שהם מייצגים סביר במבחנה מצדו אירועים במקום שילוב נכון צמתי. להתעלם כל רצפי עם רמות קרינה פלואורסצנטית ברור שיא שונה משני צדי הצומת אינטגרציה אמור ב רצף כרומטוגרפי, שכן הן הסבירות חפצים שנוצרו על-ידי זיהום צולב במהלך התגובה רצף או צינור קפילר כרומטוגרפיה. מגדירים אירועי שילוב ייחודי כמו אלה עם HBV המדויק, רצפים הסלולר בצומת תאי וירוס.הערה: חזרה על אירועי שילוב ייחודי יכול לנבוע משובט הרחבה של תאים המכילים שילובים אלו או זיהום צולב במהלך ה-PCR (אשר יכול להיבדק באמצעות שלילי-לשלוט בתגובותיו, מפורט נוסף בתוצאות נציג להלן). שילובים חוזרות לתוך רצפים ספציפיים הסלולר צפויים להציג אתרים שונים של מסוף HBV עבור כל אירוע אינטגרציה, כמו מסלולים שאינם הומולוגיים סוף מצטרף גם בשימוש15. לחשב את תדירות אינטגרציה על-ידי הכפלת הגורם דילול של תבניות DNA הפוכה על ידי מספר צמתים וירוס-תא זוהה ליד זה דילול, ואחריו נורמליזציה לסכום הכולל DNA קלט לתוך התגובה היפוך. באופן כללי, תדירות אינטגרציה היא הסדר 1:104 תאים.