Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.
Summary
Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.
Abstract
Trasmissione feco-orale di gastroenterite acuta si verifica di tanto in tanto, soprattutto quando le persone che hanno gestito il cibo e l’acqua sono infetti da Salmonella spp./Shigella spp. Il metodo gold standard per la rilevazione della Salmonella spp./Shigella spp è coltura diretta ma questo è laborioso e che richiede tempo. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per Salmonella spp./Shigella spp., screening, usando reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) combinata con cultura guidata. Ci sono due fasi principali: PCR in tempo reale e la cultura guidata. Per la prima fase (Real-Time PCR), spieghiamo ogni passaggio del metodo: esempio di collezione, pre-arricchimento, estrazione del DNA e PCR in tempo reale. Se il risultato in tempo reale di PCR è positivo, allora viene eseguita la seconda fase (guidata cultura): coltura selettiva, identificazione biochimica e sierologica caratterizzazione. Illustriamo anche risultati rappresentativi generati da esso. Il protocollo descritto qui sarebbe una valida piattaforma per lo screening rapido, specifico, sensibile ed alta-velocità di trasmissione di Salmonella spp /Shigella spp.
Introduction
La diarrea è ancora un problema di salute comune con un’alta incidenza globalmente tasso1,2. Anche se la mortalità è relativamente bassa, alcuni pazienti mostrano vari sintomi per settimane (come sgabelli allentati e acquosi, l’urgenza di andare in bagno), che rendono l’impatto socio-economico molto alto3,4. Più seriamente, alcuni pazienti possono anche sviluppare sindrome dell’intestino irritabile se lasciato non trattato5. Ci sono vari tipi di batteri, virus e parassiti che possono causare diarrea6. Salmonella spp /Shigella spp sono tra i più comuni batteri per la trasmissione di gastroenterite acuta7,8,9,10,11. Di conseguenza, molte contee hanno emesso leggi o regolamenti per regolare Salmonella spp /Shigella spp screening fra la gente che dovrebbe gestire cibo e acqua. Ad esempio, il governo cinese hanno emesso leggi obbligatorie Salmonella spp /Shigella spp screening una volta all’anno.
Il metodo gold standard per Salmonella spp /Shigella spp. rilevamento è coltura dei batteri. Attraverso la coltura dei batteri e successiva identificazione biochimica e sierologica caratterizzazione, possiamo identificare la specie di batteri, che potrebbero facilitare la gestione del focolaio di malattia e profilatura antimicrobica per facilitare il trattamento dei pazienti 12. potrebbe anche aiutare a rintracciare la fonte di infezione durante la Salmonella spp /Shigella spp. scoppio13. Tuttavia, questo metodo è laborioso (che richiedono funzionamento manuale) e che richiede tempo (prendendo diversi giorni), soprattutto per il collaudo di un gran numero di esempi7. Inoltre, vitali ma non coltivabili (VBNC) Salmonella spp /Shigella spp.,possono esistere in alcuni campioni di feci14. In considerazione di questi inconvenienti, molti laboratori hanno cercato di sviluppare nuove tecniche per la rilevazione della Salmonella spp /Shigella spp.15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25. tutti questi metodi utilizzano il test nucleare acido amplificazione (NAAT), tra i quali la reazione a catena della polimerasi (PCR) è il più comune. Uno dei principali limiti di questi metodi NAAT basata è che i batteri morti, anche batteriche detriti contenenti DNA genomic incompleta, potrebbero mostrare risultati positivi26, che in gran parte potrebbe influenzare la diagnosi accurata della malattia. Blanco et al hanno mostrato che quel saggio molecolare è altamente sensibile, non solo praticabile Salmonella nelle culture, ma anche di parziali genomi e batteri morti o impraticabili dal passato infezioni o contaminazioni26. Di conseguenza, la nuova tecnologia dovrebbe essere sviluppata.
Qui, abbiamo descritto un nuovo metodo che combina il NAAT basato su metodo e coltura. Come illustrato nella Figura 1, questo nuovo metodo si applica in tempo reale PCR prima di screening e quindi vengono inviati campioni positivi per l’identificazione e la coltura dei batteri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da Salmonella spp /Shigella spp sono spesso associati con l’intossicazione alimentare e trasmissione fecale-orale di gastroenterite acuta28,29 e il metodo di routine è laborioso o richiede molto tempo 7, descriviamo una piattaforma ad alta produttività per la Salmonella spp / proiezione diShigella spp., usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidata.
Ci sono dive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da scienza e tecnologia programma di Zhuhai, Cina (concessione numero 20171009E030064), la scienza e tecnologia programma del Guangdong, Cina (concessione numero 2015A020211004) e scienza e tecnologia programma dell’amministrazione generale di supervisione della qualità, ispezione e quarantena della Repubblica popolare cinese (concessione numero 2016IK302, 2017IK224).
Materials
| Tris | Sigma | 10708976001 | |
| EDTA | Sigma | 798681 | |
| NP40 | Sigma | 11332473001 | |
| ddH2O | Takara | 9012 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara | R040Q | |
| Nutrient Broth | LandBridge | CM106 | |
| Nutrient agar | LandBridge | CM107 | |
| Selenite Cystine medium | LandBridge | CM225 | |
| XLD | LandBridge | CM219 | |
| MAC | LandBridge | CM908 | |
| Salmonella chromogenic agar | CHROMagar | SA130 | |
| Salmonella diagnostic serum | Tianrun | SAL60 | |
| Shigella diagnostic serum | Tianrun | SHI54 | |
| anal swab (collecting tube plus) | Huachenyang | ||
| slide | Mingsheng | 7102 | |
| micro-loop | Weierkang | W511 | |
| incubator | Jinghong | DNP-9082 | |
| autoclave | AUL | SS-325 | |
| dry bath | Jinghong | KB-20 | |
| automated microbial identification system | bioMérieux | VITEK2 | other equivalent system could be used |
| fluorescent real-time PCR machine | ThermoFisher | ABI7500 | other equivalent machine could be used |
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