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医学

Un enfoque In Vitro de la terapia fotodinámica

Published: August 17, 2018
doi:
10.3791/58190
,
1Department of Dermatology,University of California, Davis, 2Dermatology Service,Sacramento VA Medical Center, 3Department of Dermatology,State University of New York, Downstate Medical Center

Summary

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir apoptosis. Presentamos un protocolo en vitro PDT diseñado para simular el PDT que puede utilizarse para estudiar las diferencias en incubación de PS y parámetros de tratamiento de la luz.

Abstract

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir la apoptosis de las células. La Federal Drug Administration ha aprobado el PDT para el tratamiento de la queratosis actínica, y guías de práctica clínicas recomiendan PDT como tratamiento para algunos cánceres de piel no melanoma y Acné vulgaris. PDT es una modalidad terapéutica ventajosa ya que es bajo costo, no invasiva y asociado con efectos adversos mínimos y asustando. En el primer paso de la TFD, PS se aplica y permite la acumulación intracelular. Posterior irradiación de la luz induce la formación de especies reactivas del oxígeno, que en última instancia puede conducir a la apoptosis celular, disrupción de la membrana, daño mitocondrial, modulación inmune, la proliferación del keratinocyte y facturación de colágeno. Adjunto, presentamos un método en vitro para estudio PDT en una línea de células adherentes. Este protocolo de tratamiento está diseñado para simular el PDT y puede ajustarse a estudiar el uso de la TFD con distintas líneas celulares, photosensitizers, temperaturas de incubación o longitudes de onda de fotoactivación. Carcinoma de células escamosas las células se incubaron con 0, 0.5, 1.0 y 2 mM de ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) durante 30 min y fotoactivado con luz 417 nm azul 1.000 s. Medida de resultado primaria fue apoptosis y necrosis, medido por citometría de flujo D anexina V y 7 aminoactinomycin. Hubo un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis de la célula después de 30 minutos incubación de 5-ALA. Para lograr alta validez de la prueba, es importante mantener la incubación constante y luz de parámetros al realizar experimentos en vitro PDT. PDT es que una investigación clínica útil del procedimiento y en vitro puede permitir el desarrollo de la novela PSs, optimización de protocolos y nuevas indicaciones de PDT.

Introduction

Terapia fotodinámica (TFD) es un procedimiento médico que involucra la incubación de un fotosensibilizador exógeno aplicado (PS) seguido por fotoactivación luz visible para inducir la apoptosis de las células. La Federal Drug Administration (FDA) ha aprobado el PDT para el tratamiento de queratosis actínica (AK), y las guías clínicas recomiendan PDT como tratamiento para algunos cánceres de piel no melanoma y el acné vulgaris1,2. Usos emergentes no dermatológicas para PDT incluyen el tratamiento de cánceres ginecológicos, próstata y gastrointestinal3. PDT es una modalidad terapéutica ventajosa ya que es bajo costo, no invasiva y asociada con mínimos efectos adversos y cicatrices2.

En el primer paso de la TFD, PS se aplica y permite la acumulación intracelular2. En los Estados Unidos, el ácido 5-aminolevulínico tópico (5-ALA) se utiliza comúnmente para tratar las AKs. Durante la incubación fase, 5-ALA se convierte en protoporfirina IX (PP-IX) a través de la ruta de biosíntesis de hemo en células incorporado3. Las células de cáncer y pre-han disminuido la actividad del ferrochelatase, que convierte la protoporfirina IX (PP-IX), en el producto final, heme. Como resultado, las células de cáncer acumulan PP-IX en comparación con las células normales4,5. Esta acumulación de PP-IX en el cáncer y las células precancerosas en comparación con el tejido circundante permite PDT a ser un enfoque orientado con mínimos efectos adversos. Irradiación de la luz conduce a oxígeno reactivo (ROS) las especies generación cuando el oxígeno acepta electrones excitados del PP-IX. PP-IX tiene un máximo de absorción en el espectro ultravioleta con pequeños picos en el espectro de luz visible, incluyendo azul y rojo luz2. Formación de ROS en última instancia puede conducir a la apoptosis celular, disrupción de la membrana, daño mitocondrial, modulación inmune, proliferación del keratinocyte y colágeno volumen6,7,8,9 , 10.

PDT se desarrolló en la década de 1970 y es una evolución de la modalidad terapéutica3. El protocolo aprobado por la FDA para el tratamiento de AKs recomienda incubación 5-ALA piel de 14 – 18 h, pero incubaciones de 1 a 2 h se utilizan en la práctica clínica2. In vitro, hemos demostrado que incubaciones de 5-ALA de 15 minutos más cortas pueden incrementar la apoptosis de las células del fibroblasto en comparación con los fibroblastos11,12. Además, se están estudiando chlorin novela, ftalocianina y PSs basados en nanopartículas para mejorar la eficacia de PDT3. Adjunto, presentamos un método en vitro para estudio PDT en un carcinoma de célula squamous adherente de las células. En este protocolo, se incuban las células SCC-13 con 0, 0.5, 1.0 y 2 mM 5-ALA de 30 min y fotoactivado con luz 417 nm azul 1.000 s. Medida de resultado primaria es apoptosis y necrosis, medido por citometría de flujo de annexin-V y aminoactinomycin 7 D (7-AAD). Este protocolo de tratamiento está diseñado para simular el PDT y puede ajustarse a estudiar el uso de la TFD con otras líneas celulares, photosensitizers, temperaturas de incubación o longitudes de onda de fotoactivación. Preparación de grupos de control adicional puede ser necesario, incluyendo el fluoróforo sin mancha, solo manchado, controles positivos y negativos para citometría de flujo. Una revisión exhaustiva de la teoría, protocolos, diseño experimental y compuerta para citometría de flujo necrosis apoptosis se puede encontrar en otra parte13.

Protocol

1. preparación de las células Placa de 20.000 células en 2 mL de medio de cultivo en cada pocillo de una placa de 6 pozos utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad. Colocar placas de 6 pocillos en una incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO2) durante 24 h permitir que las células se adhieren a las placas. 2. preparación del fotosensibilizador para el tratamiento de las células Preparar soluciones de 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA en medio de cultivo. Si el suero bovino fetal (FBS) es un ingrediente del medio de cultivo, preparar y tratar las células con 5-ALA en la solución de medio de cultivo con 0,1% FBS para incubaciones. 11 , 12 en este caso, las células SCC-13 no requieren FBS, así 5-ALA fue añadido directamente a queratinocitos medio libre de suero suplementado con extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico. Aspirar el medio de cultivo y lavar las células con al menos 2 mL de tampón fosfato salino (PBS). Aspire PBS y añadir 2 mL de las soluciones de 5-ALA 0, 0,5, 1 o 2 mM en placas separadas o pozos. Incubar las células con 0, 0.5, 1 o 2 mM 5-ALA en una 36 a 37 ° C calefacción bloque 30 min proteger las células de la exposición a la luz durante la incubación con papel de aluminio. Las soluciones de 5-ALA 0, 0.5, 1 y 2 mM de aspirar y lavar las células con 2 mL de PBS. Aspire PBS y añadir 2 mL de medio de cultivo para la irradiación de la luz azul. 3. azul fototerapia luz Antes de irradiar las células, activar el aparato de luz azul (p. ej., diodo emisor de luz, fluorescente o halógena) y duración de un ciclo (1.000 s) para calentar el dispositivo. El dispositivo de luz azul debería tener una longitud de onda de salida de 417 +/-5 nm. Permitiendo que el dispositivo funcione durante un ciclo antes de tratamientos se asegura que la longitud de onda de luz azul y la irradiación son constantes a lo largo de la fase de fotoactivación. Utilice un fotómetro para medir la irradiancia en la superficie celular. La irradiación de luz azul en la superficie de la célula debe ser 10 mW/cm2. La distancia entre la luz y las células deba ajustarse para lograr una radiación de 10 mW/cm2 según la intensidad de la fuente de luz. Coloque grupos de tratamiento ALA 0, 0.5, 1 y 2 mM sobre una superficie negra debajo de la fuente de luz azul. Irradian las células con luz azul para 1.000 s (16 min y 40 s) para un fluence total de 10 J/cm2. Después de la fotoactivación luz azul, las células están listas para análisis. 4. colección y tinción Preparar el búfer de flujo según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales). Aspirar el medio de cultivo y lavado las células con 2 mL de PBS. Añadir 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA y permiten separar por aproximadamente 3 a 5 min de las células. Las células pueden ser examinadas bajo el microscopio para confirmar la separación de la célula. Añadir 1 mL de medio de cultivo (o PBS) con 10% suero fetal bovino para desactivar la tripsina. Recoja la suspensión celular en tubos de flujo etiquetado 5 mL. Girar el tubo de flujo de 5 mL en una centrifugadora a 201 x g por 5 min aspirar solución sin remover el sedimento celulares. Agregar 200 μL de tampón de flujo con anticuerpo conjugado de annexin-V (1 μl de annexin-v por 39 μl de tampón de flujo) para cada muestra. Resuspender las células y en la incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 20 min permitir la Unión de la anexina V. Agregar 3 μl de 7-AAD a cada muestra. Incubar por 5 min a temperatura ambiente. 5. el análisis cytometric del flujo de Siga instrucciones de fabricante de citómetro de flujo para la disposición (véase Tabla de materiales). Recoger y analizar muestras con citometría de flujo. 13 Realizar una comparación estadística de los grupos de tratamiento y control mediante análisis de varianza (ANOVA)14. Comparar las medias de los grupos de tratamiento a la media del control con la prueba de Dunnett para análisis post hoc .

Representative Results

Después de SCC-13 las células fueron incubadas durante 30 minutos con 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA e irradiadas con 1.000 s de luz, hubo un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis celular azul. Total apoptosis (media ± error de estándar de la media) era de 3.94 ± 0,34, 7.90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 y 38.33 ± 1.81 después de 30 min de incubación con 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA, respectivamente y 1000 segundos de azul la luz (figura 1). Comparamos el porcentaje medio de células apoptóticas entre 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA incubado grupos mediante ANOVA. Las células tratadas con 1 y 2 mM 5-ALA tenían un aumento significativo en la apoptosis de la célula en comparación con las células tratadas de 0 mM 5-ALA. Figura 2A muestra representativa flujo cytometric gating de forward scatter (FSC) versus dispersión lateral (SSC) SCC-13 células incubadas con 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA. La compuerta del círculo encierra la población de células SCC-13. Para este experimento, se recogieron 7500 eventos y la puerta de población de células SCC-13 capturados por lo menos el 90% de los eventos. Figura 2B muestra un diagrama representativo de la 7-AAD en el eje x y la anexina V en el eje y. Las poblaciones celulares son bloqueadas en cuatro cuadrantes (Q1 a Q4) discriminar células apoptóticas. Células de Q1 (alta anexina v, bajo 7-AAD) representa que experimenta apoptosis temprana. Representan células de Q2 (alta anexina v, alta 7-AAD) sometidos a finales apoptosis o necrosis. Representa células de Q3 (baja anexina v, alta 7-AAD) que experimentan necrosis. Representa de Q4 (baja anexina v, bajo 7-AAD) las células que no experimenta apoptosis o necrosis. Para calcular el porcentaje de células que experimentan apoptosis, hemos añadido el porcentaje de células en Q1 y Q2. Discrepancia en longitud de período de incubación de 5-ALA, temperatura de incubación o fotoactivación dosis puede alterar la eficacia del PDT. Figura 3 muestra una representativa parcela citometría flujo anexina V y 7-AAD cuando se varía la temperatura de incubación (es decir, 27, 36 y 42 ° C). Hubo un aumento dependiente de la temperatura en la apoptosis. Figura 1: incremento dosis dependiente en la apoptosis después de 30 minutos de incubación de 5-ALA. 5-ALA se incubaron a 36 ° C durante 30 minutos seguidos de 1.000 s de luz azul en las células SCC-13. Las barras representan el promedio porcentuales annexin-V las células positivas en cada tratamiento y grupo control. Experimentos se realizaron por triplicado técnica. Significación estadística se determinó mediante ANOVA, p < 0.05 indicada con un asterisco (*). Barras de error representan el error estándar de media ± de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Representante flujo Cytometry parcelas. (A) representante de dispersión hacia adelante vs lado dispersión citometría parcelas en unidades arbitrarias (UA) para ejes x e y – 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA, las células incubadas. Para este experimento, se recogieron 7500 eventos y la puerta de población de células SCC-13 había capturado el 90% de los eventos. (B) representante de annexin-V vs 7-AAD flujo cytometry parcelas en AU para ejes x e y – 0, 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA, las células incubadas. Q1: temprana las células apoptotic, Q2: finales células apoptóticas/necrótico, Q3: células necróticas y Q4: células viables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: 5-ALA en diferentes temperaturas de incubación puede alterar la eficacia de la PDT. Representante de annexin-V vs citometría de flujo 7-AAD parcelas en AU para ejes x e y – SCC-13 células incubadas con 0,5 mM 5-ALA en 27, 36 y 42 ° C. Q1: temprana las células apoptotic, Q2: finales células apoptóticas/necrótico, Q3: células necróticas y Q4: células viables. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hubo un aumento significativo en la apoptosis de SCC-13 tras incubaciones de 30 min 0.5, 1 y 2 mM 5-ALA siguieron por 1.000 s de luz azul. Estos resultados son consistentes con nuestra investigación previamente publicado demostrando que incubaciones de 5-ALA de 30 min, seguida de activación luz azul conduce a un aumento dosis dependiente en el porcentaje de fibroblastos células que experimentan apoptosis12, 14.

Este enfoque experimental para estudiar PDT tiene ventajas y limitaciones. Los métodos descritos se ajustan a la práctica clínica como un PS comercialmente disponible y se utilizaron fuente de luz. Los investigadores pueden personalizar los métodos con diferentes tipos de células, PSs, fuentes de luz y parámetros de la irradiación. Sin embargo, existen limitaciones a este enfoque como este protocolo está diseñado para células adherentes en una monocapa. En la práctica clínica, las diferencias en arquitectura o enfermedad patología del tejido (es decir, hiperqueratosis o fibrosis) pueden disminuir la absorción de PS o penetración15. Como resultado, las dosis de tratamiento y los resultados experimentales no directamente correspondan a la práctica clínica. Modelos de tumores esferoide y chip de microfluidos se han estudiado métodos para replicar más de cerca tumor microambientes16,17,18. Esferoides tienen nichos celulares internas y externas que pueden incorporar el photosensitizers diferencialmente y representan arquitectura tumor heterogéneo. Otros investigadores han utilizado chips microfluídicos para condiciones de tratamiento de la pantalla y suministro vascular de photosensitizers. Sin embargo, chips microfluídicos pueden ser costosos de desarrollar o difícil de aplicar para los investigadores que no estén familiarizados con la técnica. Además, esferoides y chips microfluídicos pueden no reflejar el tratamiento clínico de los cánceres de piel en la cual photosensitizers se aplican directamente a la superficie del tumor sin diseminación vascular. Los investigadores deben evaluar los pros y contras de la cultura de monocapa, modelos de tumores esferoide y chips microfluídicos para estudiar PDT en sistemas diferentes de enfermedades. Como no existen células inmunes o matriz extracelular, no es posible determinar cómo afecta a la PDT las interacciones célula-célula compleja. Los investigadores deba confirmar en vitro resultados experimentales utilizando modelos animales y ensayos clínicos. Para lograr alta validez de la prueba, es importante mantener la incubación constante y luz de parámetros al realizar experimentos en vitro PDT.

Temperatura se sabe que alteran la eficacia de la PDT19. Un estudio demostró que la muerte celular, absorción del 5-ALA, PP IX formación y liberación de citoquinas pueden mejorar incubando células con 5-ALA en temperaturas hasta 44 ° C19. Temperatura de incubación superior a 44 ° C puede llevar a la muerte celular inducida por termales, y temperaturas de incubación por debajo de 20 ° C no pueden llevar a la absorción significativa de 5-ALA y acumulación19. Se recomienda que los investigadores realizan incubaciones de PS en un bloque de calefacción regulable en temperatura en una temperatura constante con control de confusión potencialmente efectos térmicos. Además, es importante incubar el fotosensibilizador para una cantidad suficiente de tiempo para permitir la conversión de 5-ALA en PP-IX. En este protocolo, se incubaron las células SCC-13 con 5-ALA durante 30 minutos, que con éxito indujo la apoptosis de las células. Previamente hemos demostrado que una incubación de 10 min de 5-ALA no aumentó significativamente la apoptosis en el fibroblasto en comparación con el control sin tratar fibroblastos11,14. PP-IX empieza a acumular en la piel del ratón después de 5-ALA es incubar durante 6 minutos a 37 ° C. Por lo tanto, después de diez minutos de incubación de 5-ALA, puede no haber suficiente acumulación de PP-IX para inducir la apoptosis de la célula20. Se recomienda un período de incubación mínimo de 20 a 30 min de 5-ALA basado en nuestros anteriores estudios11,14. Los investigadores deben optimizar el período de incubación basado en el laboratorio de ajuste, fotosensibilizador de interés, tipo de la célula y la indicación clínica. Experimentos de optimización y valoración de anticuerpos pueden realizarse para obtener mejores resultados utilizando las directrices de los fabricantes. Otros ensayos de interés pueden realizarse después de la fotoactivación luz azul incluyendo cuantificación de citometría de flujo dihydroethidium de ROS. 14

Variación en la cantidad de luz entregada por unidad de superficie (es decir, radiación) y dosis total de irradiación (es decir, fluence) durante la fase de fotoactivación pueden afectar la formación de ROS y de la célula apoptosis21. La relación entre la fluencia, irradiancia y tiempo puede ser descrita por la siguiente ecuación:

Fluencia (J/cm2) = irradiancia (W/cm2) x tiempo (s)

Como fluence es dependiente en el tiempo, alargando o acortando las fases de fotoactivación puede cambiar la eficacia del tratamiento. La radiación es proporcional a la distancia al cuadrado entre la fuente de luz y el tejido diana. Como resultado, si la luz está demasiado lejos, puede no haber suficiente energía de la luz entregado a los tejidos específicos para excitar el PS. alternativamente, se puede aumentar la irradiación por la luz que refleja de las superficies que rodean. Por lo tanto, se recomienda realizar irradiaciones de luz con las placas de cultivo celular colocadas sobre una superficie negra para evitar la reflexión de la luz. Los investigadores pueden adquirir comercialmente disponibles o aprobados por la FDA azul diodos emisores de luz y dispositivos fluorescentes para utilizar en experimentos de PDT, pero estos dispositivos tienen diferentes potencias y uniformidad de campo de la luz. Un fotómetro de longitud de onda específica debe utilizarse para medir la irradiancia en la superficie de la célula y la uniformidad del campo ligero antes de cada experimento para obtener resultados consistentes. Un difusor disponible comercialmente puede utilizarse para mejorar la uniformidad del campo, si es necesario.

En Resumen, hemos descrito un enfoque en vitro a investigar PDT por detalle teoría, métodos experimentales, limitaciones, peligros potenciales y las recomendaciones para la optimización. PDT es que una investigación clínica útil del procedimiento y en vitro puede permitir el desarrollo de la novela PSs, optimización de protocolos y nuevas indicaciones de PDT.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores no tienen ninguna agradecimientos.

Materials

Keratinocyte serum free medium  Thermofisher 17005042 Culture medium for SSC-13 cells
DMEM low glucose glutamax Thermofisher 10567022 Possible culture medium for other cell types
6-well culture plates Thermofisher 720083
PBS Thermofisher 14190250
0.25% Trypsin-EDTA Thermofisher 25200056
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermofisher 15250061 For cell counting and plating 
BLU-U light  DUSA Request from manufacturer Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used 
5-ALA DUSA Request from manufacturer
FBS Atlanta Biologicals C17032
FlowCellect Annexin Red Kit Millipore Sigma  FCCH100108  Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer
FACSCanto II BD Request from manufacturer Any flow cytometer may be used 
Counting Chamber Hausser 3120 For cell counting and plating 
FlowJo FlowJo Request from manufacturer Flow cytometry analysis software
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References

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Austin, E., Jagdeo, J. An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy. J. Vis. Exp. (138), e58190, doi:10.3791/58190 (2018).
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