نهج في المختبر للعلاج الضوئي
Summary
العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) هو إجراء طبي ينطوي على الحضانة لمناشئ التطبيقية محسس ضيائي (PS) تليها فوتواكتيفيشن الضوء المرئي للحث على المبرمج. نقدم بروتوكولا في المختبر التوقيت الصيفي الباسفيكي مصممة لمحاكاة التوقيت الصيفي الباسفيكي التي يمكن استخدامها لدراسة الاختلافات في حضانة PS والمعلمات ضوء العلاج.
Abstract
العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) هو إجراء طبي ينطوي على الحضانة محسس ضيائي مناشئ التطبيقية (PS) تليها فوتواكتيفيشن الضوء مرئياً للحث استموات الخلايا. وقد وافقت “الإدارة الاتحادية للمخدرات” التوقيت الصيفي الباسفيكي لعلاج تقران سافع، وتوصي المبادئ التوجيهية السريرية التوقيت الصيفي الباسفيكي لعلاج بعض سرطانات الجلد غير الميلانوما وحب الشباب. التوقيت الصيفي الباسفيكي طريقة علاجية مفيدة كما أنها منخفضة التكلفة، وغير الغازية، والمرتبطة بالحد الأدنى من الآثار الضائرة وتخويف. في الخطوة الأولى من التوقيت الصيفي الباسفيكي، يطبق PS ويسمح لهم بتجميع إينتراسيلولارلي. تشعيع الضوء اللاحقة الحث على تكوين الأنواع الأكسجين التفاعلية، والتي قد تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية المبرمج واضطراب الغشاء وتلف الميتوكوندريا، والتحوير المناعي، انتشار keratinocyte ودوران الكولاجين. وهنا، نقدم أسلوباً في المختبر لدراسة التوقيت الصيفي الباسفيكي في خط خلية ملتصقة. هذا العلاج يهدف إلى محاكاة التوقيت الصيفي الباسفيكي، ويمكن تعديل لدراسة استخدام التوقيت الصيفي الباسفيكي مع مختلف خطوط الخلايا أو الضيائية، ودرجات حرارة الحضانة أو الأطوال الموجية فوتواكتيفيشن. الخلايا الحرشفية الخلية كانت المحتضنة مع حمض 5-aminolevulinic 0، 0.5، 1.0، و 2 مم (5-علاء) 30 دقيقة وفوتواكتيفاتيد مع الضوء الأزرق نانومتر 417 1000 s. وكان قياس النتيجة الأولية المبرمج ونخر، مقاسا أنيكسين-V و 7-أمينواكتينوميسين د التدفق الخلوي. وكانت هناك زيادة الجرعة في الخلية المبرمج بعد الثلاثين دقيقة الحضانة من 5-ألاباما تحقيق عالية بين اختبار الصلاحية، من المهم الحفاظ على احتضان متسقة ومعلمات الخفيفة عند إجراء التجارب في المختبر التوقيت الصيفي الباسفيكي. التوقيت الصيفي الباسفيكي بحث الداخلي و في المختبر السريري مفيدة يمكن أن تتيح تطوير رواية PSs، الاستغلال الأمثل للبروتوكولات، ومؤشرات جديدة للتوقيت الصيفي الباسفيكي.
Introduction
العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) هو إجراء طبي ينطوي على الحضانة محسس ضيائي مناشئ التطبيقية (PS) تليها فوتواكتيفيشن الضوء مرئياً للحث استموات الخلايا. الدواء الاتحادية (FDA) قد وافقت التوقيت الصيفي الباسفيكي لعلاج تقران سافع (حزب العدالة والتنمية)، وتوصي المبادئ التوجيهية السريرية التوقيت الصيفي الباسفيكي لعلاج بعض سرطانات الجلد غير الميلانوما وحب الشباب الشائع:1،2. وتشمل الاستخدامات غير الجلدية الناشئة للتوقيت الصيفي الباسفيكي علاج سرطان الجهاز الهضمي والبروستاتا، وأمراض النساء3. التوقيت الصيفي الباسفيكي طريقة علاجية مفيدة كما أنها منخفضة التكلفة وغير الغازية، ومرتبطة بالحد الأدنى من الآثار الضائرة و تندب2.
في الخطوة الأولى من التوقيت الصيفي الباسفيكي، يطبق PS ويسمح لهم بتجميع إينتراسيلولارلي2. في الولايات المتحدة، حمض الموضعية 5-aminolevulinic (5-علاء) يستخدم عادة لعلاج إس. أثناء الاحتضان يتم تحويل المرحلة، 5-علاء إلى بروتوبورفيرين التاسع (PP-تاسعا) عبر الممر الحيوي الهيم في الخلايا المدمجة3. وانخفضت خلايا السرطان وسرطان ما قبل النشاط فيروتشيلاتاسي، والذي يحول بروتوبورفيرين التاسع (PP-التاسع)، إلى المنتج النهائي، الهيم. نتيجة لذلك تتراكم خلايا السرطان PP-تاسعا، مقارنة بالخلايا العادية4،5. يسمح هذا التراكم من PP-تاسعا في السرطان وخلايا ما قبل السرطان بالنسبة للأنسجة المحيطة للتوقيت الصيفي الباسفيكي يكون نهجاً مستهدفة مع الحد الأدنى من الأحداث الضائرة. تشعيع الضوء يؤدي إلى توليد الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية عندما يقبل الأكسجين الإلكترونات متحمس من PP إلى التاسع. وقد PP-تاسعا امتصاص ذروة في طيف الأشعة فوق البنفسجية مع قمم أصغر في جميع أنحاء طيف الضوء المرئي، بما في ذلك الضوء الأزرق والأحمر2. تشكيل روس قد تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية المبرمج واضطراب الغشاء والضرر المتقدرية، التحوير المناعي، وانتشار keratinocyte والكولاجين دوران6،7،،من89 , 10.
التوقيت الصيفي الباسفيكي في السبعينات وهو طريقة علاجية متطورة3. البروتوكول وافقت إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج المحور وتوصي الجلد 5-علاء الحضانة ح 14 – 18، ولكن يشيع استخدامها في الممارسة السريرية2إينكوبيشنز ح 1 إلى 2. في المختبر، وقد أظهرنا أن أقصر مدة 15 دقيقة 5-علاء إينكوبيشنز قد يزيد تنتجها الخلايا الليفية الخلية المبرمج مقارنة بالخلايا الليفية غير المعالجة11،12. بالإضافة إلى ذلك، تجري دراسة رواية تشلورين و phthalocyanine PSs نانوحبيبات المستندة إلى تحسين فعالية التوقيت الصيفي الباسفيكي3. وهنا، نقدم أسلوباً في المختبر لدراسة التوقيت الصيفي الباسفيكي في الخلايا الحرشفية ملتصقة الخلايا. في هذا البروتوكول، وهي المحتضنة الخلايا SCC-13 مع 0، 0.5، 1.0، 2 مم 5-علاء 30 دقيقة وفوتواكتيفاتيد مع الضوء الأزرق نانومتر 417 1000 s. قياس النتيجة الأولية هو المبرمج ونخر، مقيسة أنيكسين-V و 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد) التدفق الخلوي. هذا العلاج يهدف إلى محاكاة التوقيت الصيفي الباسفيكي، ويمكن تعديل لدراسة استخدام التوقيت الصيفي الباسفيكي مع أخرى خطوط الخلايا أو الضيائية، ودرجات حرارة الحضانة أو الأطوال الموجية فوتواكتيفيشن. إعداد مجموعات مراقبة إضافية قد تكون ضرورية، بما في ذلك فلوروفوري أونستاينيد، واحد ملون، عناصر سلبية وإيجابية للتدفق الخلوي. استعراض شامل لنظرية، والبروتوكولات، والتصميم التجريبي، والنابضة للمبرمج/نخر التدفق الخلوي يمكن الاطلاع على أماكن أخرى13.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكان هناك زيادة كبيرة في المبرمج SCC-13 بعد 30 دقيقة إينكوبيشنز من 0.5 و 1 و 5 ملم 2-علاء تليها 1,000 s للضوء الأزرق. هذه النتائج تتسق مع ابحاثنا المنشورة سابقا مما يدل على أن إينكوباتيونس 5-علاء من 30 دقيقة يليه تفعيل الضوء الأزرق يؤدي إلى زيادة الجرعة تعتمد على النسبة المئوية للخلايا تنتجها الخلايا الليفية تمر المبرمج12، 14.
وقد هذا النهج التجريبي للتوقيت الصيفي الباسفيكي دراسة مزايا وقيود. وصف أساليب تتفق مع الممارسة السريرية كملاحظة متاحة تجارياً وكانت تستخدم مصدر الضوء. يمكن تخصيص الباحثين الأساليب مع أنواع مختلفة من الخلايا، PSs، ومصادر الضوء، ومعلمات التشعيع. ومع ذلك، هناك قيود لهذا النهج كما تم تصميم هذا البروتوكول للخلايا ملتصقة مثقف في أحادي الطبقة. في الممارسة السريرية، الاختلافات في أمراض الأنسجة الهندسة المعمارية أو المرض (أي، من فرط أو التليف) قد إنقاص امتصاص PS أو ضوء اختراق15. نتيجة لذلك بجرعات العلاج والنتائج التجريبية قد لا مباشرة تتوافق مع الممارسة السريرية. وقد درست نماذج ورم كروي ورقاقة موائع جزيئية كأساليب لأوثق النسخ المتماثل الورم ميكرونفيرونمينتس16،،من1718. وقد الماغنيسيوم الكوّات الخلوية الداخلية والخارجية التي قد تدرج الضيائية خلطات وتمثل بنية الورم غير متجانسة. وقد استخدمت الباحثين الآخرين رقائق موائع جزيئية لظروف العلاج الشاشة وتوصيل الأوعية الدموية الضيائية. ومع ذلك، قد تكون رقائق موائع جزيئية مكلفة لتطوير أو صعبة التنفيذ للباحثين غير مألوف مع التقنية. وعلاوة على ذلك، الماغنيسيوم ورقائق موائع جزيئية قد لا تعكس العلاج السريري لسرطان الجلد الذي الضيائية تطبق مباشرة على سطح الورم دون نشر الأوعية الدموية. قد تحتاج إلى الباحثين لتقييم إيجابيات وسلبيات الثقافة أحادي الطبقة ونماذج ورم كروي، ورقائق موائع جزيئية لدراسة التوقيت الصيفي الباسفيكي في نظم مختلفة من الأمراض. كما لا توجد الخلايا المناعية أو المصفوفة خارج الخلية، من غير الممكن لتحديد كيفية تأثير التوقيت الصيفي الباسفيكي على التفاعلات المعقدة خلية خلية. الباحثين قد تحتاج إلى تأكيد في المختبر نتائج تجريبية باستخدام نماذج حيوانية والتجارب السريرية. تحقيق عالية بين اختبار الصلاحية، من المهم الحفاظ على احتضان متسقة ومعلمات الخفيفة عند إجراء التجارب في المختبر التوقيت الصيفي الباسفيكي.
من المعروف أن يغير فعالية التوقيت الصيفي الباسفيكي19درجة الحرارة. أظهرت إحدى الدراسات أن امتصاص 5-علاء وتشكيل PP-تاسعا، موت الخلية والإفراج عن سيتوكين قد تتعزز بحضانة الخلايا مع 5-علاء في درجات حرارة تصل إلى 44 درجة مئوية19. حضانة درجات حرارة تتجاوز 44 درجة مئوية قد يؤدي إلى موت الخلايا المستحثة الحرارية، وقد لا تؤدي حضانة درجة حرارة أقل من 20 درجة مئوية إلى كبير 5-علاء امتصاص وتراكم19. أننا نوصي الباحثين بإجراء إينكوباتيونس PS على كتلة تدفئة قابل لضبط درجة حرارة عند درجة حرارة ثابتة للمراقبة لاحتمال الخلط تأثيرات حرارية. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن احتضان محسس ضيائي لكمية كافية من الوقت للسماح بتحويل 5-علاء PP-التاسع. كانت المحتضنة الخلايا SCC-13 في هذا البروتوكول، مع 5-علاء مدة 30 دقيقة، مما فعل الخلية المبرمج بنجاح. قد أثبتنا سابقا أن حضانة 10 دقيقة 5-علاء لم يزد كثيرا المبرمج في تنتجها الخلايا الليفية بالمقارنة إلى عنصر تحكم غير المعالجة الليفية11،14. PP-التاسع يبدأ تتراكم في الجلد الماوس بعد 5-علاء هو حضانة لمدة ست دقائق عند 37 درجة مئوية. ولذلك، بعد عشر دقائق حضانة 5-علاء، ربما لا يكفي تراكم PP-التاسع للحث على الخلية المبرمج20. ونحن نوصي فترة حضانة الحد أدنى من 20 إلى 30 دقيقة 5-علاء يستند لدينا11،الدراسات السابقة14. الباحثين قد تحتاج إلى تحسين فترة الحضانة استناداً إلى مختبر الإعداد، محسس ضيائي الاهتمام ونوع الخلية، ودلالة سريرية. قد يتم تنفيذ تجارب أضداد معايرة والأمثل للحصول على أفضل النتائج باستخدام المبادئ التوجيهية للشركات المصنعة. ويمكن تنفيذ فحوصات أخرى تهم عقب فوتواكتيفيشن الضوء الأزرق بما في ذلك تدفق ديهيدروثيديوم سيتوميتريك الكمي لروس. 14
تباين كمية الضوء تسليمها لكل وحدة مساحة السطحية (أي الإشعاع) والجرعة التشعيع الكلي (أي فلوينس) أثناء مرحلة فوتواكتيفيشن قد تؤثر على تشكيل روس والخلية المبرمج21. ويمكن وصف العلاقة بين فلوينس والإشعاع، ومرة بالمعادلة التالية:
فلوينس (J/سم2) = الإشعاع (W/سم2) × الزمن (s)
كما تعتمد على الوقت فلوينس فقد تتغير إطالة أو تقصير في مراحل فوتواكتيفيشن نجاعة العلاج. الإشعاع متناسباً مع المسافة التربيعية بين مصدر الضوء والأنسجة المستهدفة. كنتيجة لذلك، إذا كان الضوء بعيداً جداً، قد لا توجد كمية كافية من الطاقة الخفيفة، سلمت إلى الأنسجة المستهدفة لإثارة س. بدلاً من ذلك، يمكن زيادة في الإشعاع بالضوء المنعكس السطوح المحيطة. ولذلك، نوصي بإجراء إيرادييشنز الخفيفة مع لوحات ثقافة الخلية وضعت على سطح سوداء لمنع انعكاس الضوء. الباحثين قد يكتسب متاح تجارياً أو وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير زرقاء خفيفة – ينبعث الثنائيات وأجهزة الفلورسنت لاستخدامها في التجارب التوقيت الصيفي الباسفيكي، ولكن هذه الأجهزة قد تكون النواتج طاقة مختلفة والتوحيد الميدانية الخفيفة. ينبغي استخدام شحني الطول الموجي الخاصة قياس الإشعاع على سطح الخلية وتوحيد حقل الضوء قبل كل تجربة لنتائج متسقة. يمكن استخدام الناشر متاحة تجارياً لتعزيز التوحيد الحقل، وإذا لزم الأمر.
وباختصار، لقد قمنا بوصف نهج في المختبر للتحقيق التوقيت الصيفي الباسفيكي بالتفصيل نظرية وطرق تجريبية، والقيود، والمزالق المحتملة وتوصيات من أجل التحسين. التوقيت الصيفي الباسفيكي بحث الداخلي و في المختبر السريري مفيدة يمكن أن تتيح تطوير رواية PSs، الاستغلال الأمثل للبروتوكولات، ومؤشرات جديدة للتوقيت الصيفي الباسفيكي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين قد لا شكر وتقدير.
Materials
| Keratinocyte serum free medium | Thermofisher | 17005042 | Culture medium for SSC-13 cells |
| DMEM low glucose glutamax | Thermofisher | 10567022 | Possible culture medium for other cell types |
| 6-well culture plates | Thermofisher | 720083 | |
| PBS | Thermofisher | 14190250 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher | 25200056 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermofisher | 15250061 | For cell counting and plating |
| BLU-U light | DUSA | Request from manufacturer | Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used |
| 5-ALA | DUSA | Request from manufacturer | |
| FBS | Atlanta Biologicals | C17032 | |
| FlowCellect Annexin Red Kit | Millipore Sigma | FCCH100108 | Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer |
| FACSCanto II | BD | Request from manufacturer | Any flow cytometer may be used |
| Counting Chamber | Hausser | 3120 | For cell counting and plating |
| FlowJo | FlowJo | Request from manufacturer | Flow cytometry analysis software |
References
- Morton, C., et al. European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy. European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).
- Ozog, D. M., et al. Photodynamic therapy: A clinical consensus guide. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).
- Abrahamse, H., Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Josefsen, L. B., Boyle, R. W. Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers. Metal-Based Drugs. 2008, 276109 (2008).
- Ohgari, Y., et al. Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin. Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).
- Kessel, D., Luo, Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).
- Goldberg, D. J. Photodynamic therapy in skin rejuvenation. Clinics in Dermatology. 26 (6), 608-613 (2008).
- Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy. Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).
- Boen, M., Brownell, J., Patel, P., Tsoukas, M. M. The role of photodynamic therapy in acne: An evidence-based review. American Journal of Clinical Dermatology. 18 (3), 311-321 (2017).
- Allison, R. R., Moghissi, K. Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).
- Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death. Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).
- Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro. Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling. JoVE. , (2018).
- Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts. British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).
- Gilaberte, Y., et al. Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy. Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).
- Yoon, H. K., et al. Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device. Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).
- Chen, Y. -. C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures. Scientific Reports. 5, 12175 (2015).
- Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. Low-dose PDT on breast cancer spheroids. Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).
- Yang, J., et al. The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).
- Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin. Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).
- Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).
