تعبير عابر في نيكوتيانا بينثاميانا يترك لإنتاج ترتيربين في نطاق التحضير
Summary
يمكن تحويل تعبير مغايرة عابر للإنزيمات السكروز في أوراق بينثاميانا نيكوتيانا الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات عالية القيمة ترتيربين جديدة. وهنا يتم وصف بروتوكول مفصلة لإنتاج إعداد مقياس السريع (5 أيام) triterpenes والنظير استخدام هذه المنصة القوية المستندة إلى النباتات.
Abstract
Triterpenes هي واحدة من أكبر ومعظم الأسر هيكلياً متنوعة من المنتجات النباتية الطبيعية. أظهرت العديد من مشتقات ترتيربين لامتلاك النشاط البيولوجي ذات الصلة طبي. ومع ذلك، حتى الآن هذه الإمكانية لم يترجم إلى عدد كبير العقاقير المشتقة ترتيربين في العيادة. وهذا يمكن القول أن (على الأقل جزئيا) تؤدي نتيجة لمحدودية الوصول الاصطناعية العملي لهذه الفئة من المجمع، وهي مشكلة يمكن خنق استكشاف علاقات الهيكل والنشاط والتنمية من المرشحين بالتقليدية الطبية كيمياء مهام سير العمل. وبالرغم من تنوعها الهائل، triterpenes جميعا مستمدة من سليفة خطية واحدة، أوكسيدوسكواليني 2 و 3. عابر تعبير مغايرة للإنزيمات السكروز في بينثاميانا أ. يمكن تحويل الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات جديدة ترتيربين ذات القيمة العالية التي لا تنتج بطبيعة الحال من هذا المضيف. الزراعية-تسلل وسيلة بسيطة وفعالة لتحقيق التعبير عابرة في بينثاميانا أ. وتنطوي العملية على تسلل أوراق النبات مع تعليق tumefaciens المتبعة تحمل construct(s) التعبير للفائدة. تسلل إضافية A. tumefaciens المشارك سلالة تحمل بناء تعبير ترميز إنزيم إمدادات السلائف ويعزز إلى حد كبير يزيد الغلة. بعد فترة خمسة أيام، يمكن حصاد نبات تسلل المواد ومعالجتها لاستخراج وعزل المنتج ترتيربين الناتجة. هذا هو عملية يتم تحجيم خطيا وبشكل موثوق، ببساطة عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة في التجربة. وهنا يتم وصف بروتوكول لإنتاج إعداد النطاق السريع triterpenes الاستفادة من هذا النظام الأساسي المستندة إلى النباتات. البروتوكول يستخدم جهاز تسلل فراغ يمكن تكرارها بسهولة، مما يتيح تسلل متزامنة من النباتات يصل إلى أربعة، وتمكين باتشويسي تسلل مئات نباتات في فترة قصيرة من الزمن.
Introduction
Triterpenes هي واحدة من أكبر ومعظم الأسر هيكلياً متنوعة من المنتجات النباتية الطبيعية. ويعتقد جميع المنتجات الطبيعية ترتيربين رغم تنوعها الهائل، المستمدة من 2 و 3 السلائف الخطي نفسها-أوكسيدوسكواليني، نتاج لمسار mevalonate في النباتات. بدأت سيكليزيشن أوكسيدوسكواليني 2 و 3 والتي تسيطر عليها عائلة من الإنزيمات يسمى أوكسيدوسكواليني سيكلاسيس (منظمات المجتمع المدني). وتمثل هذه الخطوة سيكليزيشن المستوى الأول من التنويع، مع مئات سقالات ترتيربين مختلفة وقد تم الإبلاغ عن طبيعة1. كذلك يتم تنويع هذه السقالات بالخياطة الإنزيمات بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، الفسفرة p450s1،(CYP450s)2. هذه مسارات السكروز يمكن أن يؤدي إلى تعقيدات هائلة، تؤدي أحياناً إلى المنتجات النهائية التي يتم التعرف عليها بالكاد من ترتيربين الأصل. على سبيل المثال، يعتقد البنية المعقدة لإبادة الحشرات و antifeedant azadirachtin ليمونويد قوية تستمد ترتيربين tetracyclic من نوع تيروكالاني3.
أظهرت العديد من ترتيربين الطبيعية المنتجات المشتقة، حتى تلك ذات الأصل غير معدلة نسبيا السقالات، تمتلك النشاط البيولوجي ذات الصلة طبي4،5،،من67. ومع ذلك، حتى الآن هذه الإمكانية لم يترجم إلى عدد كبير العقاقير المشتقة ترتيربين في العيادة. وهذا يمكن القول أن (على الأقل جزئيا) تؤدي نتيجة لمحدودية الوصول الاصطناعية العملي لهذه الفئة من المجمع، وهي مشكلة يمكن خنق استكشاف علاقات الهيكل والنشاط والتنمية من المرشحين بالتقليدية الطبية كيمياء مهام سير العمل.
تعبير عابر للإنزيمات ترتيربين السكروز من سائر الأنواع النباتية في أوراق بينثاميانا أ. يمكن تحويل الإمدادات المحلية من 2، 3-أوكسيدوسكواليني نحو إنتاج منتجات عالية القيمة ترتيربين جديدة (الشكل 1). يمكن استخدام هذه العملية وظيفيا تميز المرشح الإنزيمات وإعادة بناء مسارات السكروز من نواتج الأيض الهامة التي تحدث طبيعيا. على قدم المساواة، فإنه يمكن أيضا استغلالها في النهج السكروز اندماجي إنتاج منتجات ترتيربين الرواية، واستراتيجية التي يمكن أن تسفر عن مكتبات النظير هيكلياً المتصلة بها، مما يتيح الاستكشاف المنهجي لعلاقات الهيكل والنشاط يؤدي نشاطا بيولوجيا مركبات8،9.
أجروينفيلتريشن وسيلة بسيطة وفعالة لتحقيق التعبير عابر في أوراق بينثاميانا أ . وتنطوي العملية على تسلل يترك مع تعليق A. tumefaciens تحمل construct(s) التعبير ثنائي للفائدة. ويتحقق هذا عن طريق تطبيق الضغط الذي يجبر السائل من خلال الثغور، مما أدى إلى تشريد الجوية في الفضاء بين الخلايا، والاستعاضة عنه بتعليق A. tumefaciens . نقل البكتيريا كل منهما تي-السلطات الوطنية المعينة إلى داخل الخلايا النباتية، أسفر عن التعبير البروتين المترجمة وعابر في أنسجة نبات تسلل.
بينما أي ناقل ثنائي مناسب لتوليد النباتات المعدلة وراثيا يجوز للتعبير عابرة، فنحن نستخدم المستمدة من اللوبيا فسيفساء فيروس كبمف هايبرترانسلاشونال (HT) البروتين التعبير نظام10، 11. في هذا النظام هو محاط الجينات التي تهم المناطق غير مترجمة (UTR) من الحمض النووي الريبي كبمف-2. 5 ‘ UTR يحتوي على تعديلات أدى إلى مستويات عالية جداً من البروتين الترجمة مع لا الاعتماد على النسخ المتماثل الفيروسية12. هذا الأسلوب قد وضعت في سلسلة متجه ثنائي سهلة وسريعة (بيك) الذي يتضمن الموقع جزئ استنساخ المتوافقة مع بروتوكول نيات (بيك-HT-DEST)10،11. تحتوي معظم بيك ناقلات أيضا طماطم حيلة كثيف المستمدة من الفيروسات P19 إسكات القامع جينات13 داخل الجزء تي-دنا من كاسيت التعبير، التي تلتف الحاجة إلى كوينفيلتراتي سلالة منفصلة تحمل P19 ويتيح جداً تعبير البروتين رفيع المستوى في البلد المضيف زرع خلية10،11.
استخدام بينثاميانا أ كمضيف تعبير له مزايا خاصة عند العمل مع مسارات السكروز النبات. وتؤيد العمارة خلية عضويا مرناً المناسبة وتجهيز البروتين، والتقسيم السليم، بالإضافة إلى امتلاك الإنزيمات المشاركة الضرورية، ريدوكتاسيس (على CYP450s)، والسلائف الأيضية. مصدر الكربون هو التمثيل الضوئي؛ وهكذا، يمكن ببساطة زراعة النباتات في السماد جيدة النوعية، التي تتطلب فقط الماء و أول أكسيد الكربون2 (من الهواء) وأشعة الشمس كمدخلات. النظام الأساسي أيضا مريحة للغاية للتعبير المشترك عن تركيبات مختلفة من البروتينات، كما يمكن تحقيق فاسيليلي بتسلل المشارك من سلالات مختلفة من A. tumefaciens، يلغي الحاجة إلى بناء تعبير مولتيجيني كبيرة أشرطة الكاسيت. وعلاوة على ذلك، العملية يمكن أن يكون خطيا وبشكل موثوق تحجيم ببساطة عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة في التجربة.
العمل السابق في المختبر أثبتت فائدة هذا منهاج مقياس محضرة التجارب. هذا وشملت إعداد triterpenes رواية لاستخدامها في فحوصات بيواكتيفيتي ومقياس حتى تحقيق غرام كميات من المنتجات المعزولة. وعلاوة على ذلك، يمكن زيادة تراكم منتجات ترتيربين ايربان عدة مرات قبل المشاركين التعبير عن شكل اقتطاع N–المحطة الطرفية، وردود الفعل غير متحسسة من هيدروكسي-3, 3-ميثيجلوتاري-إنزيم ريدكتيز (ثمجر)، حد من معدل المنبع إنزيم في مسار mevalonate8.
هو المفتاح لهذه التجارب وإعداد مقياس القدرة على مريح يصل حجم عملية تسلل. في تجربة نموذجية، عشرات ومئات نباتات قد يكون ضروريا لتحقيق الكمية المستهدفة للمنتج معزولة. التسلل إلى أوراق فردية باليد (باستخدام المحاقن لا داعي لها) عمليا صعبة وباهظة وكثيراً ما تستغرق وقتاً طويلاً، مما يجعل هذا الأسلوب غير عملي للارتقاء بالروتينية. تسلل فراغ يوفر مزايا أكثر من التسلل من ناحية، كما أنها لا تعتمد على مستوى المهارة للمشغل ويسمح تسلل مساحة أكبر من سطح ورقة. يتم استخدام هذا الإجراء تجارياً لإنتاج البروتينات الدوائية14على نطاق واسع. هذا البروتوكول يستخدم جهاز يمكن تكرارها بسهولة تسلل فراغ، التي يمكن بناؤها من أجزاء المتاحة تجارياً. يسمح هذا التسلل متزامنة من النباتات يصل إلى 4، منح تسلل باتشويسي السريع والعملي لمئات نباتات في فترة قصيرة من الزمن (الشكل 2a -2b). يتألف الجهاز تسلل فراغ فرن الفراغ الذي يشكل غرفة عمليات التسلل (الشكل 2 واو). الفرن متصل بمضخة عن طريق خزان فراغ. وهذا يقلل كثيرا من الوقت اللازم لتحقيق الفراغ المطلوب في قاعة عمليات التسلل. النباتات هي المضمونة في حامل مفصل ومقلوب في حمام مائي الفولاذ المقاوم للصدأ 10 لتر مليئة بتعليق A. tumefaciens (الشكل 2a -2 (ج)). المهم الغمر الكامل من أجزاء الجوي من النباتات لكفاءة عمليات التسلل. حمام الماء ثم يوضع داخل قاعة تسلل (الشكل 2d –2e)، وفراغ تطبيقها على رسم الهواء خارج المساحات المتداخلة ليف. بمجرد الضغط انخفض بمقدار 880 [مبر] (عملية التي تستغرق حوالي 1 دقيقة) قاعة تسلل يتم إحضارها بسرعة العودة إلى الضغط الجوي على مدى 20-30 ثانية عن طريق فتح صمام مدخل الفرن، عندها اكتمال عمليات التسلل.
خمسة أيام بعد تسلل المواد النباتية على استعداد لاستخراج الجني واللاحقة والعزلة للمنتج المطلوب. من هذه النقطة هو ببساطة العملية واحدة لاستخراج المنتجات الطبيعية وتنقيتها من المواد ليف، سير عمل مألوفة لأي كيميائي منتج طبيعي. وتوجد العديد من أساليب مختلفة لاستخراج الأولية واللاحقة تنقية15. اختيار أنسب الأساليب والظروف الدقيقة المستخدمة تعتمد اعتماداً كبيرا على خصائص كيميائية خاصة مجمع للفائدة، بالإضافة إلى توافر مهارات و/أو المعدات. من غير الممكن أن تدرج في هذا البروتوكول أسلوب خطوة بخطوة، وقابلاً للتعميم الكامل لتجهيز المواد أوراق النبات المقطوع للمنتج المعزولة التي يمكن اتباعها عمياء لأي منتج ترتيربين من اهتمام المتلقين للمعلومات، ولا يكون المناسبة لمحاولة القيام بذلك. بيد أن هذا البروتوكول سوف تقدم لمحة عامة عن سير العمل الأساسية المستخدمة في المختبر وبعض الطرق للمراحل المبكرة من العملية، التي أثبتت التعميم لمنتجات ترتيربين aglycone الأكثر اﻷوكسيجين في تجربتنا. وهذا يشمل اثنين من التقنيات غير شائع نسبيا، أي استخراج المذيبات المضغوط (PSE)، وأسلوب مرحلة مريحة لإزالة الكلوروفيل راتنج تبادل الأيوني أساسية بشدة باستخدام.
PSE تقنية عالية كفاءة لاستخراج الجزيئات العضوية الصغيرة من مصفوفات الصلبة. يتم تنفيذ عمليات الاستخراج تحت ضغط (ca. 100-200 بار)، أشر حاليا القدرة على استخدام تخفف من درجات الحرارة التي تتجاوز الغليان والميزة الرئيسية لاستخراج المذيبات. وهذا يمكن أن تقلل الوقت وكمية المذيب المطلوبة لتحقيق استخراج حصرية، بالمقارنة مع التقنيات الأخرى الساخنة المذيبات مثل refluxing بسيطة أو عمليات الاستخراج سوكسهليت16. الصكوك PSE أعلى هيئة تجارية متوفرة، التي تستخدم الخلايا استخراج للتبادل، والمذيبات الآلي المناولة والتدفئة، والرصد. وهذا يجعل هذا الأسلوب مريحة للغاية. وأيضا جدلا أقل خطورة، خاصة بالنسبة للمشغلين ذوي الخبرة المحدودة الكيمياء العملية.
تصبن مقتطفات ليف النفط الخام تحت ارتداد متبوعاً بسائل/التقسيم تقنية شائعة لإزالة الجزء الأكبر من تشلوروفيلس قبل تنقية اللاحقة أو التحليل. لكن هذا يمكن غالباً ما يكون عمليا تطالب في جداول أكبر. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون الكشف عن واجهة، أو فقدان المنتج بسبب تشكيل مستحلبات إشكالية. يمكن استخدام راتنجات التبادل الأيوني بقوة أساسية لأداء المرحلة ايربان التحلل المائي بمثابة بديل مناسب. ما زال يلتزم الراتنج المصطبغة جزء الكلوروفيل طحين ويمكن إزالتها ببساطة عن طريق الترشيح. ويستخدم هذا البروتوكول للتكيف مع حجم محضرة من الإجراءات التحليلية سبق الإبلاغ عنها17 التي توظف راتنج تبادل الأيوني أساسية متاحة تجارياً.
فيما يلي يصف لنا بروتوكول مفصل وسريع لإنتاج نطاق محضرة triterpenes الاستفادة من هذا النظام الأساسي المستندة إلى النباتات. هذا البروتوكول يستخدم بشكل روتيني في المختبر لإعداد عشرات ومئات ملليغرام من المنتج ترتيربين معزولة لتطبيقات هذا وصف هيكلي بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي)، و/أو مواصلة الدراسة في الوظيفية فحوصات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسلل فراغ عالية عن طريق وضع يسمح هذا البروتوكول لاستخدامها بشكل روتيني في المختبر لإنتاج مركبات ترتيربين من الفائدة لمختلف التطبيقات المصب محضرة. ويتكرر بسهولة تسلل فراغ جهاز الموصوفة هنا. بالإضافة لخزان فراغ من المستحسن لتقليل الوقت المطلوب لسحب الفراغ اللازمة، ولكن من الممكن ببساطة إعادة توظيفها فرن فراغ غير معدلة كغرفة عمليات التسلل. حماية مضخة فراغ عن طريق إضافة مكثف مناسبة معقولة من الناحية النظرية، ولكن في مختبرنا وجدنا هذا غير ضروري.
تغطية تسلل الخطر إذا كان يترك لا مغمورة تماما في وقف عمليات التسلل. يتم تصغير هذه المشكلة بضمان أن يصل مستوى التعليق إلى السطح العلوي لصاحب المصنع، وأن صاحب المصنع تناسب ضيق للحمام تسلل. نلاحظ من الشكل 2 أن السطح العلوي لصاحب المصنع هو راحة في إلى حمام تسلل عندما تكون في المكان. ويتحقق ذلك بلوحات على حواف الحامل المتوسطة التي تشكل نقطة الربط مع الجزء العلوي من الحمام تسلل. سوف تتطلب وقف تسلل الإضافات الدورية للحفاظ على مستوى التعليق. وهذا يتحقق على أفضل وجه بإضافة تعليق تسلل الزائدة لمنع تخفيض تدريجي ل التطوير التنظيمي600 على مدى تسلل باتشويسي كبيرة. ومع ذلك، في أيدينا، الاستعاضة عن الماء لا يبدو لها تأثير ملحوظ على الغلة المتوقعة على نطاق محضرة، على الرغم من أن هذا لم يكن كوانتيتيفيلي التحقيق. يمكن تسللت إلى النباتات كم من دفعة واحدة لوقف عمليات التسلل لا تزال مسألة مفتوحة. نحن التسلل بشكل روتيني بين 100 و 200 من النباتات مع دفعة واحدة لوقف عمليات التسلل. وباﻹضافة إلى ذلك، فمن الطبيعي لبعض التربة ليتش في وقف تسلل خلال عملية تسلل. قد لا تم العثور على أن يكون لها تأثير ملحوظ على فعالية عمليات التسلل.
خلال موسم الحصاد فمن المستصوب (ولكن لا حرج) لحصاد سوى الأوراق التي كانوا تسللوا إلى (بعض أوراق سوف تزرع تسلل فيما بعد). يمنع الحصاد الانتقائي تمييع مع أنسجة غير المنتجة، مما سيزيد إلا النسبة الشوائب الذاتية بالنسبة إلى مجمع للفائدة. وهذا له أثر رمزي على سهولة تنقية المصب، ويزيد من حجم هذه العمليات. عند استخدام ثمجر لتعزيز إمدادات السلائف، كثيرا ما لوحظ من النمط الظاهري نيكروسيد تتطور على مدى فترة النمو بعد انتهاء عمليات التسلل. وهذا أمر طبيعي وفعلا الإيدز الحصاد الانتقائي وعملية التجفيف المتلقين للمعلومات. ويمكن تخزين مسحوق الأوراق المجففة عادة في حاوية محكمة الإغلاق في مكان بارد، جاف، والظلام، ولكن من الناحية المثالية في مجفف تحت الفراغ. وهذا يعتمد على استقرار المجمع من المهتمين. توخي الحذر في حالة اختيار لتخزين في ثلاجة-80 درجة مئوية. التأكد من أن المجففة يترك حاوية لماء، وعلى إزالة من المخزن، تسمح هذه الحاوية الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الافتتاح. عدم القيام بذلك سيؤدي إلى الترطيب من الأوراق، التي تعرقل تجهيز تيار أسفل.
يتم توفير الخطوات ما بعد الحصاد في هذا البروتوكول لأغراض توضيحية، وتجربة لمساعدة هؤلاء الباحثين الذين قد تكون محدودة الكيمياء العملية. أنها يمكن أن تكون بديلاً للعديد من تقنيات الاستخراج/تنقية المنتجات الطبيعية الأخرى. كما هو مفصل في المقدمة، PSE مزايا كثيرة ولكن العاصمة التكلفة المتاحة تجارياً PSE الجهاز قد تكون باهظة، وليس من الضروري. العلاج راتنج التبادل الأيوني الأساسية وسيلة مريحة للغاية لتحل محل التقليدية تصبن متبوعاً بتقسيم/سائل. ومع ذلك، أنها ليست مناسبة للمنتجات التي تحتوي على حمض الكربوكسيلية الجماعات أو المجموعات الوظيفية التي سوف تحلل الظروف الأساسية، مثل اﻻسترات. هذه المنتجات يتوقع الإبقاء على راتنج التبادل الأيوني الأساسية. ومع ذلك، هناك إمكانية لاستغلال هذا لالتقاط والإفراج عن الإجراء (لم يتم توثيقها هنا). حيث سيكون من المناسب تصبن التقليدية، يقدم العلاج راتنج التبادل الأيوني الأساسية كبديل مناسب. قد وجد اللوني للطريقة الموضحة في الخطوة رقم 9، يكون قابلاً للتعميم للمركبات المبينة في الشكل 3. ومع ذلك، قد تتطلب مركبات قطبية زيادة فترة ممتدة شطف وخلات الإيثيل 100%. فيما يتعلق بالخطوة 9.2، تنقية غرامة المتلقين للمعلومات الخاصة بمجمع تماما، وهو أيضا وتعتمد على مقياس. جولات متكررة من اللوني فلاش أصغر حجماً مع التدرجات الأمثل، عادة ما تكون كافية لتحقيق درجة نقاء مناسبة لتحليل الرنين المغناطيسي النووي. على نطاقات أوسع، بلورة غالباً بديلاً ملائماً. وفي الحالات الصعبة، يمكن أن تستخدم محضرة أو شبه محضرة عالية الأداء اللوني السائل ([هبلك]) تبعاً للكمية المطلوبة من مجمع معزول. أمثلة على عمليات تنقية المصب لمجموعة من المركبات تمثيلية ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى8.
البروتوكول الحالي، كما عرضت هنا، يستخدم بشكل روتيني في المختبر، وقد ثبت الأداة المساعدة. ومع ذلك، هناك مجال لا يزال كبيرا لمزيد من التحسين منهاج التعبير. والعمل جار في المختبر للتحقيق في كيفية مواصلة مسار الهندسة ومراقبة مستويات البروتين التعبير التفاضلية يمكن تحسين إنتاج ترتيربين علاوة على ذلك، بينما الوساطة سمية للخلايا المضيفة. هناك أيضا إمكانية للتحقيق في التلاعب بنظم النقل داخل الخلايا،من2021، والاتجاه للإنزيمات إلى الأقسام الخلوية المختلفة22،23، السبل التي يمكن أن تحسن الكفاءة أحداث أكسدة متعددة. ويمكن أيضا استكشاف الفوائد المحتملة لتعديل مورفولوجية العضيات الرئيسية الكامنة. وقد لوحظ على سبيل المثال، overexpression من الغشاء مجال التمويل نبات همجر للحث على تضخم هيولى في24من النباتات؛ موقع رئيسي للنشاط CYP450. هذا البروتوكول يعتبر مثاليا لإنتاج مليغرام غرام على نطاق كميات من المنتجات ترتيربين، ويمكن أن تستخدم في إعداد بحوث للحصول على مركبات لدراسة المتلقين للمعلومات (مثلاً، الاستكشاف المنهجي للهيكل والنشاط العلاقات، والتحقيقات الأولية في خصائص الحرائك الدوائية وميكروبيولوجية لقيادة المركبات ذات الأهمية السريرية). ومع ذلك، المنهاج خطيا وموثوق للتحجيم ببساطة عن طريق زيادة عدد النباتات المستخدمة، والطابع العملي للتعبير عابر عبر أجروينفيلتريشن ثبت على نطاق صناعي لإنتاج البروتينات الصيدلية 14، وبالتالي هناك إمكانية لهذا النظام الأساسي تمديد للإنتاج التجاري من تريتيربينيس ذات القيمة العالية. بدلاً من ذلك، أنها أيضا يمكن أن يتصور إنتاج مستقر ترانسفورمانتس تحمل في مسار السكروز مولتيجيني الرغبة في صيغتها النهائية، مما يسمح زراعة جماعية واستمرار ‘تربية’ المعدلة وراثيا بينثاميانا أ. سلالات إنتاج مركبات مختلفة ذات قيمة تجارية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل بها نورويتش البحوث بارك سنهم (الابن)، الهندسة المشتركة، ومجلس بحوث العلوم الفيزيائية/التكنولوجيا الأحيائية و BBSRC مجلس بحوث العلوم البيولوجية الممول أوبينبلانت بحوث البيولوجيا التركيبية المركز منح (BB /L014130/1) (M.J.S.)، أنطونيو اونوراتي)؛ جون إينيس مركز تبادل المعرفة وتسويقها منح (BB/KEC1740/1) (باء)؛ ومنح البرنامج الاستراتيجي المعهد BBSRC ‘جزيئات من طبيعة’ (BB/P012523/1)، ومؤسسة جون إينيس (أنطونيو اونوراتي). نود أن نشكر لومونوسوف جورج لتوفير ناقلات بيك وأندرو ديفيس للتصوير الفوتوغرافي.
Materials
| GC-MS instrument | any | n/a | |
| Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
| Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
| Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
| Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
| Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
| Standing incubator | any | n/a | |
| Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
| Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
| 9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
| Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
| Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
| Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
| Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
| Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
| Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
| Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
| Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
| Balance (2 figures) | any | n/a | |
| Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
| A -80 freezer | any | n/a | |
| Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
| Safety glasses | any | n/a | |
| Lab coat | any | n/a | |
| Autoclave | any | n/a | |
| Consumables | |||
| Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
| Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
| Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
| Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
| Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
| Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
| HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
| Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
| Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
| Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
| Reagents | |||
| Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
| Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
| Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
| 2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
| MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
| KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
| 3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
| Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
| Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
| Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
| Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
| Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
| LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
| Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
| NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
| KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
| Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
| Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
| Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
| Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
| Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
| Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
| Ethanol | VWR | 20821-330 | |
| Milli-Q water | any | n/a | |
| Levington F1 Compost | any | n/a | |
| Levington F2 Compost | any | n/a | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
| pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
| pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
| A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
| GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
| GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
| GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
| PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
| dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
| RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
| RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
| Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
| Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |
References
- Thimmappa, R., et al. Triterpene biosynthesis in plants. Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).
- Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins. Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).
- Roy, A., Saraf, S. Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).
- Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review. RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).
- Liby, K. T., Sporn, M. B. Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease. Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).
- Yadav, V. R., et al. Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer. Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).
- Christensen, L. P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects. Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).
- Reed, J., et al. A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules. Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).
- Andersen-Ranberg, J., et al. Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis. Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).
- Peyret, H., Lomonossoff, G. P. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants. Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).
- Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants. Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).
- Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication. Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).
- Voinnet, O., et al. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).
- Holtz, B. R., et al. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals. Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).
- Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. Natural product isolation – how to get from biological material to pure compounds. Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).
- Kaufmann, B., Christen, P. Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction. Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).
- Larsen, E., Christensen, L. P. Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables. Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).
- Sainsbury, F., et al. Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways. Methods Enzymology. , 185-202 (2012).
- Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA Cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).
- Ting, H., et al. SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana. Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).
- Wang, B., et al. Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua. Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).
- Nielsen, A. Z., et al. Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis. ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).
- Dong, L., et al. Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments. New Phytologist. 209, 679-690 (2016).
- Ferrero, S., et al. Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells. Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).
