本协议描述了 heterobifunctional 硅烷偶联剂在硅氧化物表面上的共价固定化, 其作用是以原子力显微镜为基础的单分子力光谱学为例。RrgA (pilus-1 尖黏附)与纤连蛋白的相互作用。
近年来, 原子力显微镜 (AFM) 基于单分子力谱 (smf) 扩展了我们对分子性质和功能的理解。它使我们有机会探索生物物理机制的多样性,例如, 细菌 adhesins 如何更详细地绑定到宿主表面受体。除其他因素之外, smf 实验的成功取决于固体表面和 AFM 尖端的生物分子的功能性和本地固定性。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 蛋白质与硅表面的共价耦合, 用硅烷-PEG-羧基和建立良好的 n-hydroxysuccinimid/1-3-(3-二甲基氨基丙基) carbodiimid (EDC/NHS) 化学, 以目的探讨 pilus-1 黏附 RrgA 与细胞外基质蛋白纤维结合体 (Fn) 在革兰阳性菌肺炎链球菌中的相互作用。我们的结果表明, 表面功能化导致 Fn 在玻璃表面的均匀分布, 并在 AFM 悬臂尖的适当浓度 RrgA, 明显的目标值高达20% 的互动事件在 smf测量和揭示, RrgA 绑定到 Fn 的平均力量 52 pN。该协议可以调整到夫妇通过网站特定的自由硫醇组。这将导致预定义的蛋白质或分子方向, 并适用于除 smf 之外的其他生物物理应用。
在光学和磁性镊子旁边, 原子力显微镜 (AFM)1,2已经成为一个有用的工具来分析和操纵分子和探测它们的性质和功能, 包括它们对外力的反应3 ,4。与酶联免疫吸附试验 (ELISA)、表面等离子体共振 (SPR) 或石英晶体天平 (QCM) 设置的方法相比, AFM 允许测量单分子 (smf)5和单细胞水平 (SCFS) 6 的相互作用..这些技术对诸如大肠杆菌pilus 蛋白 FimH 与甘露糖7的相互作用、或由金黄色葡萄球菌结合蛋白形成的串联β拉链重复等约束机制有很有价值的洞察力。绑定到 Fn8时。我们最近能够表明, pilus-1 黏附 RrgA9,10从革兰氏阳性菌肺炎链球菌(肺炎)11能够绑定到纤连蛋白12它的两个终端域。这揭示了一个新的双域绑定机制, 它不同于串联β拉链, 并可能使 piliated 肺炎球菌形成和保持一个瞬态接触到纤维连接蛋白-包含主机表面13。
smf 实验的成功取决于固体表面和 AFM 尖端的生物分子的功能性和本地固定性。由于在 smf 测量过程中可能发生高作用力, 因此蛋白质最好是共价键耦合到表面。有许多不同的联结方法为固定化蛋白质和其他生物分子, 并且整个细胞在 (无机) 固体表面, 纳米微粒和其他设备描述在文献14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27。这些协议经常使用有害物质, 很难执行和/或需要特殊设备 (例如, 等离子清洗器)。将分子与玻璃结合的一个简单方法是, 将 heterobifunctional 交联剂的较厚的聚合物层附着在一侧的硅烷反应基团上, 另一侧为胺反应基团。根据应用情况, 偶联剂可以包括可变长度的柔性水碳链,如polyethylenglycol (PEG)。它们压制修饰表面的非特定相互作用 (如疏水性、静电和 van-范德华相互作用), 并可提供耦合分子旋转自由。
在这里, 我们描述了一个通用的协议, 包括一个或多个自由氨基组 (-NH2) 的蛋白质共价耦合的玻璃表面和氮化硅 AFM 小贴士通过heterobifunctional 乙氧基硅烷-PEG-羧基 (-COOH)。该协议可用于 smf 实验, 这是基于 RrgA 和细胞外基质蛋白 Fn 相互作用的例证 (见图 1为概览)。
第一步是表面的硅烷化28,29,30,31。它涉及偶联剂中乙氧基基团的水解, 以形成高活性的 SiOH 基团。这些可能与基板上的 SiOH 组发生反应。在最初的凝结步骤中, 这些 silanols 形成氢键并在基体上扩散。在二次冷凝反应 (通常需要热量或真空去除水), 硅氧烷债券形成。这导致在共价键附上有机硅烷层数。
第二步是蛋白质与功能 (-COOH) 组的耦合, 从聚合物32扩展。首先, 酸转化为反应性 n-hydroxysuccinimid (nhs) 酯中间体, 这是通过建立良好的 nhs/EDC (1-乙基 3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimid 化学33 , 并进行亲核替代最后形成一个酰胺键与主要胺在蛋白质。
这样, RrgA 被耦合到氮化硅原子力显微镜的尖端和人类 Fn 到玻璃基底上的随机方向和他们的相互作用的力量, 分析了单一分子水平。我们的研究结果表明, 所描述的表面化学导致 Fn 在玻璃表面的均匀分布和在尖端的适当浓度的 RrgA, 明显的目标值20% 的互动事件在 smf 测量。这种化学减少了非特定的背景相互作用, 在数据采集过程中很少发生变化, 因此非常适合于精确的 smf 实验。
自采用 AFM 为基础的 smf 以来, 它发展成为一种广泛使用的技术, 直接探测单个蛋白质、核酸和其他生物分子3、4、5的内和分子间力。对于成功的 smf 实验, 适当的表面耦合策略是一个先决条件。为了探测天然和合成聚合物中的分子内作用力, 聚合物可以直接耦合到基体表面和 AFM 尖端36,38,39,40,41。然而, 对于分子间相互作用的研究, 例如分子键, 最好使用灵活的链接分子, 如异双 PEG 连接器或多肽链, 将相互作用的伙伴连接到 AFM 尖端和承印物表面, 为了允许正确的取向的结合伙伴, 克服短距离表面力和避免变性和展开的蛋白质21,22,23, 24,25,26,27,42。因此, 我们描述了一个简单和直接的前协议, 以共价键固定的蛋白质通过其可接触的主要胺使用异双 PEG 间隔。
我们证明了它的适用性, 研究黏附 RrgA 之间的相互作用的肺炎和细胞外基质蛋白 Fn, 最近详细描述了13。
表面化学的建立和分析和相似的方法已经成功地用于多个 smf 实验19,42,43,44,45。用于将硅烷聚合物与表面耦合的 silylether, 受水解。水解程度取决于形成的硅氧烷键的数量, 在硅烷化过程中可以控制。如果在 smf 测量过程中预期有高相互作用力 (≥ 1000 pN), 硅烷化应通过气相沉积30来完成, 从而形成连续的硅氧烷层。至于许多实验 (例如, 许多蛋白质-蛋白质相互作用), 相互作用的力量是在几个百 pN 范围之内, 并且被描述的做法, 硅氧烷形成由沉积从水阶段和未绑定有机烷用乙醇 (步 1.1.7) 冲洗, 然后用热固化 (步骤 1.1.8), 是足够的。
另一个关键步骤是将其余的1.2.3 和 NHS 分子从表面上清洗 (步进), 因为剩饭剩馀会导致蛋白质上的羧基基团活化。这可能会导致在同一表面上的蛋白质交联, 这可以改变其功能或共价键夫妇活化蛋白的其他蛋白质在相反的表面。这可能导致夹紧的蛋白质之间的表面和 AFM 尖端, 这导致高断裂力可能伴随的领域展开 (见图 3b, 跟踪 1, 4 和 5, 展开的 Fn 域)46。如果 PEG 间隔的活性 NHS 酯不饱和, 同样的问题也会发生。因此, 推荐用三缓冲盐水孵化 (步 1.2.6), 作为三止渴的主要胺的剩余氨基反应基团。
随着协议的逐步形成, 硅烷化玻璃表面的 Fn 的均匀分布 (见图 2), 留下了蛋白质的二聚体形式。这类似于解决方案中的 Fn´s 结构, 与以前的 AFM 数据在其他样品表面37相一致。此外, 还获得了 AFM 尖端上适当浓度的 RrgA, 它在 smf 测量过程中产生了20% 个定义良好的交互事件的目标值 (图 3和图 4)。另一种优雅的方法来控制耦合到样品基板和悬臂尖端的分子量, 除了改变蛋白质浓度和/或孵化时间, 是硅烷-剂与不同的次级功能组的组合。通过改变由 PEG 聚合物延伸的蛋白质活性基团的比例, 固定化蛋白的数量可以控制在15、16、17、18。
这里描述的协议也可以用来固定其他 NH2含有分子或调整到夫妇的蛋白质, 其他硅氧化物表面, 除了玻璃和氮化硅。根据蛋白质的设计, 胺反应羧基可改为巯基反应基团 (如maleimide 或邻吡啶基二硫醚),通过其自由–SH 组对蛋白质进行耦合。对于 Fn, 这将导致预定义的方向13、17、20。
总之, 该协议可以调整, 以满足不同的要求, 并适用于其他生物物理应用, 除了单分子力光谱学实验。
The authors have nothing to disclose.
结核病和 HG 通过欧洲研究理事会承认财政支持 “Cellufuel, 高级赠款294438号”。HCS 承认联邦教育和研究部通过 Innovationsallianz Technofunktionale Proteine (TeFuProt) 提供的财政支持, 党卫军承认巴法力亚国家科学和教育部提供的财政支持。通过研究重点 “Herstellung 和 biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe 慢跑”。我们感谢康尼 Hasselberg 和玛蒂娜 Hörig 的技术支持
Material | |||
2-Propanol | Carl Roth | 6752 | |
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | 03450 | EDC |
Acetic acid | Carl Roth | 3738 | 100 %; analytical purity |
Doubly distilled water | |||
Ethanol | Carl Roth | 9065 | ≥ 99.8 %; analytical purity |
Ethoxy silane polyethylene glycol acid | Nanocs | PG2-CASL-5k | 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3 |
Hydrochloric acid | Carl Roth | X896 | 32 % |
N-Hydroxysuccinimid | Merck | 804518 | NHS; for synthesis |
Phosphate Buffered Saline – Dulbecco | Biochrom | L1825 | PBS |
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma | Sigma-Aldrich | F1056 | |
Probe molecule e.g. RrgA | Produced in laboratory | ||
Sodiumchlorid | Carl Roth | 9265 | NaCl |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Carl Roth | AE15 | ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Beakers | |||
Glass cutter | |||
Glass slides | Carl Roth | 0656 | |
Inert gas desiccator | Sicco | ||
Inverted Microscope – Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | ||
JPK NanoWizard 1 | JPK Instruments | ||
JPK NanoWizard SPM and DP software | JPK Instruments | ||
Laboratory oven | Binder | ||
Magnetic stirrer | IKA | ||
Micro spatula | |||
Microcentrifuge tubes | |||
Microsoft Excel | Microsoft | ||
Parafilm M | Brand | 701606 | |
Petri dishes | |||
pH-meter | Knick | ||
Pipettes | Starlab | 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl | |
Precision balance | Acculab | ||
Silicon nitride cantilever – MLCT | Bruker AXS S.A.S | Spring constant ≤ 100 pN/nm | |
Sonication bath | Bandelin | ||
Staining jar | |||
Stereo microscope – Zeiss Stemi | Zeiss | ||
Stir bar | |||
Kimtech science precision wipes | Kimberly-Clark | ||
Twezzers | |||
UV PenRay | UVP, LLC | 90-0012-01 | Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm |
Vacuum desiccator | |||
Vacuum pump | |||
Vortex mixer | VWR | ||
Weighing paper | Carl Roth | TP64 |