Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi
Summary
Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.
Abstract
Dynamics mevcut anlayış ve yapısal özellikleri T-hücre sinaptik arayüzlerin düzlemsel bilayers Cam destekli ve vitrokullanımı ile büyük ölçüde kararlı olmuştur-türetilmiş T-Hücre klonlar ya da hatları1,2 ,3,4. Bu bulgular birincil insan T hücrelerine kan gelen izole veya lenfoid uygulamak nasıl dokular bilinmemektedir, hücre Analizi5için yeterli sayıda almak üzere kısmen önemli zorluklar nedeniyle. Burada bu bir teknik etkinleştirme ve adezyon molekülleri içeren düzlemsel lipid bilayers oluşturmak için çok kanallı akışı slaytlar istismar geliştirilmesi yoluyla ele. Akış slaytlar düşük yüksekliği hızlı hücre sedimantasyon hücre: bilayer eki, böylece araştırmacılar sinaptik arabirimi oluşumu dinamik ve granül yayın kinetik çalışmaya izin eşitlemek için teşvik etmektedir. Biz az 10 olarak sinaptik arabiriminin analiz etmek için bu yaklaşım uygulamak4 ‘ e 105 birincil cryopreserved T hücreler lenf düğümleri (içinde) ve periferik kan (PB) izole. Sonuçları ortaya çıkarmak roman düzlemsel lipid bilayer tekniği birincil insan T hücreleri kan ve doku bağlamında sağlık ve hastalık, türetilmiş biyofiziksel özelliklerini sağlar.
Introduction
T-hücre bağışıklık sinapslarda ve T hücrelerinin fonksiyonel etkinlik onların bağlantı yapısal özelliklerinden bilimsel bilgi öncelikle hücre hatları kursundan üretti ve PB türetilmiş klonlar. Bu bulgular için birincil T hücreleri arasında bir ilişki ne derece elde kan veya insan lenfoid doku kalır belirsiz, lenfoid ve diğer dokularda bulunan T hücre sinaptik arabirimleri şu ana kadar analiz değil gibi. Önemlisi, gelişmekte olan verileri doku yerleşik ve lenfoid organ elde T hücreleri fenotip ve fonksiyonel etkinlik bu PB6,7göre önemli farklılıklar olabileceğini göstermektedir. Bu daha fazla daha iyi birincil insan T hücreleri T-hücre sinaptik arabiriminde özelliklerini anlamak gerek katılaşmış.
Bu amaçla, biz bize insan PB ve LN. izole az 105 birincil T hücreleri ile T-hücre/bilayer arayüzleri görüntüleme gerçekleştirmesini sağlayan çok kanallı akışı slaytlar içine yerleştirilmiş lipid bilayers istismar bir roman mini ölçek yaklaşım geliştirdik Bu roman tekniği daha iyi model ve in vivo hücre-hücre etkileşimleri anlamak için birincil insan T-hücre sinaptik arabirimleri biyofiziksel özelliklerini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan roman tekniği konvansiyonel akışı hücre5 düzlemsel bilayers oluşturmak için gerekli benzer reaktifler kullanır ve başarıyla birincil insan T hücre – bilayer arabirimleri3,4 görüntüleme gerçekleştirmek için uygulanabilir ,15. Teknik floresan molekülleri kullanımı önemli bir azalma sunmaktadır ve 10-20 daha az T hücreleri ile karşılaştırıldığında birinci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser desteklenmiştir Michael R. Betts için R01AI118694 NIH grant tarafından alt Ödülü 566950 Yuri Sykulev içerir. Sidney Kimmel Kanser Merkezi Bioimaging paylaşılan kaynak mükemmel desteklerinden dolayı teşekkür ediyoruz.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
- Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
- Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
- Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
- Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
- Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
- Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
- Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
- Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
- Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
- Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
- Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
