פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.
Abstract
לימודי שינויים דינמיים בתרגום חלבונים דורשים שיטות מיוחדות. כאן נבחנו שינויים בחלבונים מסונתז לאחרונה, בתגובה איסכמיה, פגיעה reperfusion באמצעות הלב העכבר perfused מבודדים בשילוב עם polysome פרופיל. כדי להבין עוד יותר את השינויים הדינמיים בתרגום חלבונים, אנחנו מאופיין mRNAs זה היו מפוצצות ריבוזומים cytosolic (polyribosomes או polysomes) וגם התאושש polysomes מיטוכונדריאלי ו לעומת התפלגות mRNA וחלבון ב יעילות גבוהה שברים (מצורף mRNA הריבוזומים רבים), נמוך-יעילות (פחות ריבוזומים מצורף) אשר כללה גם את polysomes מיטוכונדריאלי, השברים ללא תרגום. miRNAs ניתן גם לשייך mRNAs זה מתורגם, ובכך להפחית את היעילות של תרגום, שבדקנו את חלוקת miRNAs לאורך השברים. ההתפלגות של mRNAs, miRNAs חלבונים נבדק בתנאים perfused הבזליים, בקצה של 30 דקות של איסכמיה זרימה לא גלובלי, ואחרי 30 דקות של פגיעה reperfusion. כאן אנו מציגים את שיטות השתמשו כדי לבצע ניתוח זה — בפרט, הגישה אופטימיזציה של חלבון החילוץ של מעבר הצבע סוכרוז, כמו זה לא תואר קודם — ולספק תוצאות נציג.
Introduction
הלב מגיב לפציעה של איסכמיה (I), פגיעה reperfusion (R) בצורה דינמית. עם זאת, יש קצת תובנה חריפה לשינויים סינתזת חלבונים במהלך התגובה. כדי לטפל בבעיה זו, לקחנו היתרון של השיטה ומבוססת של polysome פרופיל1 כדי לזהות שינויים בשפע חלבון המשקפים הפצה של הריבוזומים ו translational גורמים רגולטוריים מ ציטוזול כדי polysomes, ו לודיג לאחרונה מסונתז חלבונים (NSPs). בסביבה של אני / R, הגדלת סינתזת החלבון החדש מתרחש במסגרת זמן זה אינו עולה בקנה אחד עם שעתוק של mRNAs חדש2; יתר על כן, הכתבים בין רמות הביטוי mRNA ושפע חלבון כבר דווח על3. מסיבות אלה, בחרנו לנתח השינויים פרוטאום דינמי כפי שהיא משתקפת תרגום החלבון. כדי לעשות זאת, אנחנו לכמת mRNA שברים polysome, ולנתח את הרכב החלבון בשברים polysome. לבסוף, מאחר מיקרו Rna (מירס) לווסת את הזמינות של mRNAs לתרגום יכולים להפריע היעילות של חלבון תרגום4,5, בדקנו את ההפצה של מירס בחלקים polysome, התמקדות תגובה / רבי
בחרנו להשתמש בעכבר מבודד Langendorff זלוף המודל לבין רקמת שנקטפו בתנאים הבזליים של רציף זלוף, אחרי איסכמיה זרימה לא גלובלי 30 דקות, ואחרי 30 דקות של איסכמיה ואחריו 30 דקות של פגיעה reperfusion. אנחנו solubilized את רקמת הלב ואז מופרדים polysomes מעבר הדרגתי סוכרוז, ואחריו פרוטיאומיה מבנית ניתוח וזיהוי סלקטיבי של mRNAs ושל miRNAs ע י PCR microarray, בהתאמה. שילוב זה של שיטות מייצג גישה רב-עוצמה להבנת פרוטאום דינמי, המאפשר זיהוי סימולטני של mRNA, miRNA, NSPs, כמו גם הפצה מחדש של חלבוני, miRNA ו- mRNA בין שברים nontranslating, יעילות נמוכה polysomes, יעילות גבוהה polysomes (ראה איור 1). תובנות ברגולציה דינמי של תהליך זה יורחב על ידי ניתוח נוסף של זירחון של גורמים רגולטוריים מרכזיים כגון eIF2α או mTOR. צעדים בודדים אלה מתוארים עכשיו בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח הפרופיל polysome מאפשר המחקר של תרגום חלבונים על-ידי ניתוח המדינה translational של mRNA ספציפי או את כל transcriptome6,7. זה גם לעזר רב כאשר תרגום מקומי צריך להילמד כמו synaptosomes8. באופן מסורתי, שיטה זו כרוכה ההפרדה של מונו – polyribosomes ואת mRNAs המשויך את הדרגה סוכרוז א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HL112730 NIH P01 (סמרטוט, JVE), NIH R01 HL132075 (סמרטוט, JVE), מרכז הלב של ברברה סטרייסנד נשים (סמרטוט, JVE), דורותי, ליון פיליפ אי יו ר בקרדיולוגיה מולקולרית (סמרטוט), אריקה גלייזר ניחן כסא בריאות הלב של האישה (JVE), האקדמיה למדעים הצ’כי תמיכה מוסדית RVO: 68081715 (MS).
Materials
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO4 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. | ||
References
- Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
- Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M., Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
- Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
- Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
- Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
- Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
- Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
- Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
- Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
- Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
- Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
- Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
- Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
- McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
- Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R., Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
- Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
- Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
- Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
