Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Monozyten, Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) sind myeloische Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark, in erster Linie durch einen Prozess namens Myelopoiesis entstehen. Gemeinsamen myeloische Vorläuferzellen (CMPs) haben das Potenzial, myeloische Zellen, als auch Megakaryozyten und Erythrozyten, aber nicht lymphoiden Zellen zu produzieren. Granulozyten-Monocyte Stammväter (GVP), die von CMPs abgeleitet sind, Granulozyten und Monozyten zu produzieren, aber Megakaryocyte und Erythrozyten mögliche verloren haben. Monozyten und klassische und plasmazytoide DCs (cDCs/pDCs) sind auch gedacht, um ergeben sich aus gemeinsamen Vorfahren bekannt als Monocyte-DC Stammväter (MDPs), die entstehen durch CMPs. schrittweise Einschränkung der Linie Potenzial letztlich zu Lineage-committed führt Vorfahren: Granulozyt Stammväter, Monocyte Stammväter und dendritischen Zellen Stammväter (Abbildung 1).

Weissman und Kollegen berichteten, dass CMPs im Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– (LKS^–) CD34 gefunden werden⁺ FcγR^lo Bruchteil der Maus Knochenmark, während GVP in der LKS^– CD34 enthalten sind⁺ FcγR ^Hallo Bruchteil¹. Jedoch sind diese “CMP” und “GMP” Fraktionen sehr heterogen. Beispielsweise enthält der “GMP” Bruch auch Lineage-committed Granulozyten Stammväter und Monocyte Stammväter^1,2. MDPs wurden separat berichtet, dass CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ Vorfahren, die auch CD34 und FcγR^3,4Ausdrücken. MDPs geben Anlass zu cDC/pDC-Herstellung von gemeinsamen DC Stammväter (CDPs), die untere Ebenen des c-Kit (CD117) Ausdrücken gemeldet wurden und sind nicht in den LKS^– Teil⁵enthalten.

Zuvor war davon auszugehen, dass Monozyten über einen einzigen Weg (CMP-GMP-MDP-Monocyte) entstehen. Einklang mit diesem Modell, Monocyte begangen Stammväter, produziert von GVP (benannt Monocyte Stammväter, m/s)² und MDPs (benannt gemeinsame Monocyte Vorfahren, cMoPs)⁶ scheinen die gleichen Zellen auf der Grundlage der gemeinsamen Oberfläche Marker Ausdruck . Aber wir vor kurzem gezeigt, dass Monozyten unabhängig von GVP und MDPs produziert werden, und konnten durch einzellige RNA Sequenzierung⁷m/s und cMoPs unterscheiden.

Wir vor kurzem verändert die Weissman “CMP” und “GMP” gating Strategie um 6 Unterfraktionen C57BL/6J Maus Knochenmark mit verschiedenen Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen zu identifizieren. Wir zunächst berichtet, dass für Ly6C und CD115 Färbung die Isolation der Oligopotent GVP und Granulozyten Stammväter (GPs) sowie Monocyte Stammväter (m/s und cMoPs, die wir derzeit nicht in der Lage erlaubt, zu trennen sind) aus dem “GMP” Teil² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^Hallo Tor; ( Abbildung 1). Wir später gezeigt, dass MDPs überwiegend in der “CMP” Fraktion gefunden werden (CD34 LKS^{– +} FcγR^lo Tor), die enthält auch Flt3⁺ CD115^lo und Flt3^– Teilmengen⁷ (Abbildung 1 ). Die CMP-Flt3⁺ CD115^lo Bruchteil ergibt GVP und MDPs Adoptiv Übergabe. Die CMP-Flt3^– Teilmenge enthält Stammväter, die Vermittler zwischen CMP-Flt3⁺ CD115^lo Zellen und GVP zu sein scheinen. Im Gegensatz zu MDPs besitzen die CMP-Flt3⁺ CD115^lo und CMP-Flt3^– Fraktionen auch Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten.

Es ist wichtig, Beachten jedoch, dass es derzeit unklar ist, ob die “CMP” Fraktionen Vorfahren enthalten, die sind wirklich Oligopotent (z. B. einzelne Zellen innerhalb der CMP-Flt3⁺ CD115^lo Bruch, die Neutrophilen, besitzen Monocyte, DC Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten), oder alternativ eine Mischung aus Vorfahren mit engeren Linie Potenzial umfassen. Koloniebildenden Assays (Methylcellulose Kulturen) offenbart Zellen mit Granulozyten (Neutrophilen), Erythrozyten, Monocyte und potenzielle Megakaryocyte (GEMM Zellen) in der “CMP” CMP-Flt3⁺ CD115^lo und CMP-Flt3^– Fraktionen^{1 ,7}, aber nicht zulassen, dass die Bewertung des DC-Potentials. Im Gegensatz dazu koloniebildenden Assays zeigte die Existenz von Oligopotent GVP (Stammväter mit Neutrophilen und potenzielle Monocyte) im “GMP” Bruchteil^1,2, und dies wird unterstützt durch den letzten einzellige transkriptomischen Analyse⁸. Es ist nicht aktuell, aber bekannt, ob diese Oligopotent GVP auch andere Granulozyten (Eosinophile, Basophils und Mastzellen produzieren).

Basierend auf diesen Studien zeigen wir nun wie 7 Marker (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C und CD115) Oberfläche lässt sich identifizieren und isolieren diese 6 Teilmengen von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen. Das hier beschriebene Protokoll kann angewendet werden, für in-vitro- Kultur Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente bei Mäusen und molekulare Analyse (Bulk- und einzellige RNA-Sequenzierung, Western blotting, usw.).

Das Protokoll besteht aus 3 Phasen: (1) Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension des Knochenmarks Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen (magnetisch aktivierte Zellsortierung), und (3) Identifizierung und Isolierung, falls gewünscht, der Stammvater Teilmengen von Flow zytometrie (mit einem Analysator oder einen Sorter je nach Bedarf). Der erste Schritt ist die Isolierung von Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine euthanasierten Mäuse und ist vergleichbar mit anderen zuvor beschriebenen Protokolle⁹. Als nächstes wird die Probe für die Stamm- und Vorläuferzellen Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen Zelle oberflächenmarker der Erythrozyten, Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten usw. , die differenzierte Zellen zum Abbau bereichert. Dies ist nicht obligatorisch, aber dringend empfohlen, Erkennung der Stammvater Teilmengen zu optimieren und reduzieren die Menge der Stammvater Identifizierung benötigten Antikörper und der Zeitaufwand für Durchflusszytometrie. Die Linie Erschöpfung Protokoll unten beschreibt Magnetic-Activated Zelle Sortieren (MACS) mit einem Maus-Linie Zelle Erschöpfung-Kit (enthält biotinylierte Antikörper gegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, und Ter-119, plus Anti-Biotin Microbeads) und eine automatisierte Magnetabscheider. Der letzte Schritt ist die Identifizierung (und sortieren, wenn gewünscht) der Stammvater Teilmengen von Durchflusszytometrie. Die Antikörper-Panel unten beschrieben (siehe auch Tabelle 1) wurde entwickelt, um in einem Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) mit 4 Laser verwendet werden (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Abbildung 1: Neutrophilen, Monocyte und DC Stammväter und Differenzierung Wege. Die kürzlich überarbeitete Modell der Myelopoiesis⁷ ist mit die Weissman Tore für “CMPs” (blau) und “GVP” (grün)¹ überlagert dargestellt. Diese Zahl wurde von Yáñez Et Al. 2017⁷geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.