Summary

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Published: September 25, 2018
doi:

Summary

ここでは、ドロップオフ ddPCR と加水分解プローブの一意のペアを使用して単一の反作用で対象地域の複数の遺伝子の変異を正確に定量化するためのプロトコルを提案する.

Abstract

液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応 (ddPCR) は、ナノサイズの水-油の個々 の反作用の数千にサンプル分別に基づく高感度の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 法です。最近では、ddPCR は循環腫瘍 (葉緑体) DNA 検出の最も正確で重要なツールとなっています。標準的な ddPCR 技術の主要な限界の 1 つは、特定加水分解プローブ各対立遺伝子のバージョンを認識し、必要な反応あたり上映することができます変異数の制限です。別の方法、ドロップオフの ddPCR では、プローブで検出し、対象地域における潜在的すべての遺伝的変化を定量化するの 1 つのペアだけが必要なので、スループットが向上します。ドロップオフの ddPCR は、単一の反作用で突然変異の大きい数を検出の利点と従来の ddPCR の試金に匹敵する感度を表示します。コスト効率の高い、貴重な試料を節約、変異をアプリオリに知られていないとき検出ツールとして使用することができます。

Introduction

何千もの癌の開発に関連する体細胞突然変異は報告された1をされています。これらのうち、いくつかの標的療法2,3の有効性予測マーカー、遺伝のこれらの突然変異のスクリーニングは今日常診療。液滴デジタル PCR (ddPCR) の技術は高い検出精度と突然変異の有無を監視するため、非侵襲的な液体生検45と高い互換性。ただし、試金 ddPCR 現在主に先天的な知られている突然変異を検出する設計されています。突然変異が知られている場合、これは深刻な検出ツールとして ddPCR の使用が制限されます。確かに、従来の ddPCR デザインの野生型対立遺伝子 (WT プローブ) を認識し加水分解プローブは突然変異体の対立遺伝子 (MUT プローブ) (図 1 a) を認識し、特定のプローブと競合します。高い親和性プローブは、テンプレートに交配し、対応する遺伝子の性質を示す、その蛍光を解放します。各液滴の得られた蛍光データは、別の次元で WT とムトのプローブによって放出される蛍光を表す散布で視覚化できます。従来の ddPCR の試金のための典型的な結果の概略は、図 1 aに提示されます。この例では、青、雲は水滴、MUT の対立遺伝子が増幅され MUT プローブによって識別されるに対応する赤い雲に対し WT プローブによって識別される WT 対立遺伝子を含んでいる小滴に対応します。反応に読み込まれている DNA の量、に応じて WT とムトの産物を含む二重肯定的な液滴は (緑雲) を表示できます。光の灰色の雲は、空の液滴に対応します。

以来、ほとんどのプラットフォームは、フルオロ (通常 2、5 までが) の限られた数の検出を実現、従来の ddPCR のスループットが制限されています。したがって、複数の隣接する遺伝子変異を有する地域をターゲット技術的に困難な多重 ddPCR 試金または並行各突然変異を対象とする複数の反応の使用の設計が必要です。WT 加水分解プローブの一意のペアを使用してターゲット領域内の遺伝的改変を検出できる可能性があるので、ドロップオフ ddPCR 戦略はこの制限を克服します。ターゲット地域と 2 番目のプローブ (プローブ 2) に隣接する非可変シーケンスは突然変異が、対象地域の WT シーケンスに補足最初のプローブ (プローブ 1) のカバーには、(図 1 b) が期待されています。最初のプローブは、反応における無衝突分子の合計量を定量化中、2 番目のプローブは突然変異体シーケンスにサブ最適な交配によって WT とムトの対立遺伝子を識別します。プローブ 2 は、複数のターゲット地域 (単一または複数のヌクレオチドの置換、削除、)6の突然変異の種類を識別できます。従来の ddPCR のように光の灰色の雲は、DNA 分子を含まない水滴に対応します。それはこのタイプの試金、WT とムトの雲の最適な分離は WT だけを含んでいる小滴から WT とムトのターゲット遺伝子を含んでいる小滴を区別できないので、反応に読み込まれている DNA の量に依存していることを思い出すことが重要フォーム。したがって、この試金はほとんど水滴が目標とされた遺伝子の 1 つ以上のコピーを含める必要があります。

Protocol

ここで提示されたプロトコルの Institut キュリーの倫理ガイドラインに従います。人間のすべてのサンプルは、インフォームド コンセント、Institut キュリー制度審査委員会で承認された研究の後、登録された患者から得られました。 1. 血液 DNA 抽出プラズマ ・ コレクション 注: 任意の種類の「組織」から抽出した DNA を使用できます (例えば、?…

Representative Results

概念実証研究 FFPE 組織やドロップオフ ddPCR 戦略6を使用して癌から血漿検体でKRASエクソン 2 変異 (コドン 12 と 13) とegfr 遺伝子エクソン 19 削除を調べた。 KRASドロップオフ プローブは、複数人間癌11既知のKRAS変異の 95% 以上あるのエクソン 2 のKRAS遺伝子?…

Discussion

効率的なドロップオフ ddPCR アッセイを設計、最適化が重要であり、プロトコルを慎重に従う必要があります。プライマーとプローブの各組み合わせが一意の PCR 反応効率。したがって、個々 のアッセイは、貴重な試料を使用する前にコントロールのサンプルを注意深く検証します。最適化、検証、ピーク信号検出を証明し、特異性と感度を評価する重要です。プロトコルに従って、「プロー…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、Institut キュリー SiRIC (グラント インカ DGOS 4654) によって支えられました。著者感謝したいまたキャロライン ヘゴ ビデオへの彼女の貢献のため。

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender) BD 367863 EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) Qiagen 55114 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) Qiagen 937556 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system Qiagen 9001297 fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus Qiagen 19413 For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226 The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader Bio-Rad 186-3003 or186-4003, respectively The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator Bio-Rad 186-3002 or 186-4002, respectively Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851196 Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer Bio-Rad 181-4000 PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder Bio-Rad 186-3051 Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets Bio-Rad 186-4007 Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix Bio-Rad 186-3010 ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates Eppendorf 951020362 96-well semi-skirted plates
Foil seal Bio-Rad 181-4040 Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL Eppendorf 0030 108.051 Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set HORIZON HD780 The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 Life Technologies Q32854 The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer

References

  1. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  2. Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
  3. Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
  4. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
  5. Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
  6. Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
  7. Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
  8. Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
  9. Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
  10. Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
  11. Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).

Play Video

Cite This Article
Decraene, C., Bortolini Silveira, A., Michel, M., Bidard, F., Pierga, J., Stern, M., Proudhon, C. Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions. J. Vis. Exp. (139), e58051, doi:10.3791/58051 (2018).

View Video