Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System

Cristina Pornaro; Stefano Macolino; Michael D. Richardson

doi:10.3791/58042

JoVE Journal > Environment

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

环境科学

Vegetatieve en wortelstokken van Turfgrasses meten met behulp van een digitale afbeelding analysesysteem

Published: February 19, 2019

doi:

10.3791/58042

Cristina Pornaro¹, Stefano Macolino¹, Michael D. Richardson¹

¹Department of Agronomy, Food, Natural Resources, Animals, and Environment,University of Padova, ²Department of Horticulture,University of Arkansas

Summary

Het systeem van de analyse van een software gebaseerde image biedt een alternatieve methode om te studeren van de morfologie van soorten stoloniferous en vaste. Dit protocol maakt meting van de lengte en de diameter van de vegetatieve en wortelstokken en kan worden toegepast op monsters met een grote hoeveelheid biomassa en op een grote verscheidenheid van soorten.

Abstract

Lengte en diameter van de vegetatieve of wortelstokken zijn meestal gemeten met behulp van eenvoudige linialen en remklauwen. Deze procedure is traag en moeizaam, dus het vaak op een beperkt aantal vegetatieve of wortelstokken gebruikt wordt. Om deze reden, zijn deze eigenschappen beperkt in hun gebruik voor Morfologische karakterisering van planten. Het gebruik van technologie van de software van de analyse van het digitale beeld kan meetfouten als gevolg van menselijke fouten, die meestal toenemen naarmate het aantal en de grootte van de monsters ook verhogen overwinnen. Het protocol kan worden gebruikt voor elk soort gewas maar is met name geschikt voor voedergewassen of grassen, waar planten klein zijn en talrijk. Gras monsters bestaan uit bovengrondse biomassa en een bovenste bodemlaag om de diepte van maximale rizoom ontwikkeling, afhankelijk van de soort van belang. In studies, monsters worden gewassen uit de bodem en vegetatieve/wortelstokken worden met de hand schoongemaakt vóór de analyse door de software van de analyse van de digitale afbeelding. De monsters worden verder gedroogd in een laboratorium verwarming van de oven voor het meten van drooggewicht; daarom voor elk monster zijn de resulterende gegevens gemiddelde diameter, totale lengte en totale droge gewicht. Gescande afbeeldingen kunnen worden gecorrigeerd voordat analyse door met uitzondering van zichtbare vreemde onderdelen, zoals de resterende wortels of bladeren niet verwijderd met het reinigingsproces. Deze fragmenten inderdaad normaal veel kleinere diameter dan vegetatieve of wortelstokken, zodat ze gemakkelijk van de analyse kunnen worden uitgesloten door de vaststelling van de minimale diameter beneden welke objecten worden niet beschouwd als. Stolonen of wortelstok dichtheid per oppervlakte-eenheid kan vervolgens worden berekend op basis van de grootte van steekproef. Het voordeel van deze methode is snel en efficiënt meting van de lengte en de gemiddelde diameter van grote steekproef nummers van vegetatieve of wortelstokken.

Introduction

De studie van de morfologie van de plant is grotendeels gericht in alle disciplines van de wetenschap van de planten met inbegrip van ecologie, agronomy, biologie en fysiologie. Het wortelgestel van de plant is het wijd studeerde voor haar belang in stress tolerantie, stabiliteit van de bodem, plantengroei en productiviteit. Vegetatieve en wortelstokken zijn ook op grote schaal studeerde voor hun rol in de plant propagatie strategieën, yogatechnieken vermogen en opslag van koolhydraten. Vegetatieve en wortelstokken zijn gemodificeerde stengels, die horizontaal, hetzij boven de grond (vegetatieve groeien) of onder de grond (wortelstokken). Vegetatieve en wortelstokken ook bevatten regelmatig regelafstand knooppunten en groeispurt, evenals meristemtisch knooppunten die kunnen die aanleiding geven tot nieuwe wortels en scheuten¹. Er zijn een groot aantal studies over verschillende onderwerpen onderzoeken vegetatieve, wortels en wortelstokken van verschillende planten²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^, ⁸. Wortelsystemen, vegetatieve en wortelstokken van turfgrasses worden bestudeerd vanwege hun belang in gras kwaliteit⁹, lente groen-up na de winter-rustperiode¹⁰, en slijtage tolerantie en yogatechnieken vermogen¹¹. Deze organen worden bovendien ook in andere gewassen, zoals rijst¹², soja⁴, maïs¹³en weilanden waar laterale stengels een sleutelrol in de bodemerosie control^{5 spelen}turfgrasses bestudeerd.

Root lengte dichtheid (wortel lengte per volume van de bodem) en gemiddelde diameter zijn doorgaans gemeten met behulp van scanning software³^,⁴^,⁵^,⁹^,¹⁴^,¹⁵^, ¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Omgekeerd, de lengte en diameter van vegetatieve of wortelstokken worden meestal gemeten met een liniaal en remklauw van³^,¹⁹^,²⁰ en vereisen heel wat tijd en arbeid²¹^,²² ^, ²³ ^, ²⁴. Daarom, zij worden vaak gemeten in een beperkt aantal vegetatieve of wortelstokken¹¹^,²⁰^,²⁵ en zijn vaak beperkt tot de morfologische karakterisering van verdeelde planten alleen. De studie van stolonen en rizoom eigenschappen in een volwassen luifel omvat een grote hoeveelheid biomassa bemonstering zodat meestal alleen stolonen en rizoom drooggewicht dichtheid (droge gewicht per eenheid van oppervlak) zijn vastberaden⁷^,¹¹^, ²⁶ ^, ²⁷. stolonen drooggewicht, in feite, kunnen gemakkelijker gemeten dan stolonen lengte en diameter door het drogen van de monsters in een oven. Stolonen lengte is echter een belangrijke soorten en rassen teken dat geen goed gerelateerd aan drooggewicht. Een recente studie op sluipende overblijvende raaigras (Lolium perenne) aangetoond dat monsters met een hoge stolonen lengte dichtheid niet per se hoge stolonen gewicht dichtheid^{6 hoefde}.

Beeldanalyse systemen maken de analyse van de wortels sneller²⁸^,²⁹, nauwkeuriger, en minder vatbaar voor menselijke fouten³⁰^,²¹ dan de traditionele, handmatige methoden³¹^,³²^, ³³. Bovendien, deze systemen bieden hoge beweeglijkheid en easy-to-use hulpmiddelen met inbegrip van het licht, optische setup, en de resolutie, die vaak zijn gekalibreerd voor elk gescand beeld³⁴. Pornaro et al. ²⁴ aangetoond dat het WinRHIZO systeem, een systeem voor de analyse van afbeelding is speciaal ontworpen voor de meting van de wortels van het gewassen,, een alternatieve methode leveren kan voor het analyseren van stolonen en rizoom eigenschappen meer volledig dan de huidige methoden door het overwinnen van meetfouten veroorzaakt door menselijke fouten. Voor een beschrijving van de morfologische en kwantitatieve informatie over stolonen en rizoom groei, kunnen beeldanalyse systemen worden gebruikt voor het analyseren van een groot aantal monsters snel, zelfs met een grote hoeveelheid biomassa, waardoor verhoogde statistische precisie. Daarom, wortel analyse softwarepakketten bieden een alternatieve, betrouwbare en snelle methode voor het bestuderen van de groei en de morfologie van de vegetatieve en wortelstokken van verschillende plant soorten²⁴.

Presenteren we een experiment uitgevoerd in het noordoosten van Italië om te studeren stolonen en rizoom ontwikkeling van vier cultivars van bermudagrass (Cynodon spp.). De studie gericht op het vergroten van kennis over de ontwikkeling van de vegetatieve en wortelstokken in geplaatste (“LaPaloma” en “Yukon”) en vegetatief (“Patriot” en “Tifway”) cultivars van bermudagrass. Het experiment werd opgericht in mei 2013, en turf monsters werden genomen meer dan drie bemonstering data per jaar, vanaf de herfst van 2013 tot de zomer van 2015 [maart (vóór de groene up), (volledige groeiseizoen) juli en oktober (vóór de winter-rustperiode)]. Voor de beschrijving en uitleg van deze methode gebruikten we monsters die in de zomer van het tweede groeiseizoen (juli 2014), als de grote biomassa van de monsters op dit moment gerechtvaardigd de behoefte aan een snelle analyse. De WinRHIZO, een hulpprogramma voor digitale beeld-analyse software speciaal ontworpen voor gewassen wortel metingen, werd gebruikt om te bepalen van stolonen lengte dichtheid en gemiddelde diameter.

Protocol

1. verzamelen van biomassa monsters Verzamelen van de monsters, met inbegrip van de bovengrondse biomassa en een bodemlaag met een passende diepte afhankelijk van soort (voor soorten gras, een 15 cm diepte is over het algemeen voldoende) om de collectie van zowel de vegetatieve en de wortelstokken.Opmerking: Over het algemeen perceelsgrootte moet worden beschouwd alvorens aan te vangen van de studie, aangezien destructieve monsters zal worden genomen. In het algemeen, hoe langer het experiment is uitgevoerd, hoe groter het vereiste plot. Controleren van de bodemgesteldheid voor sample collectie: als de bodem te droog, vooral in zware gronden is, kan moeilijk worden monsters te verzamelen. In dit geval bevloeiing van de percelen voor collectie te verzachten monster lagen. Verzamelen van de monsters met behulp van een Steekmonster boren (≥ 8 cm diameter) of de oppervlakte om te verzamelen met een frame te definiëren (≥ 10 x 10 cm), en het verzamelen van de monsters met een spade. Label elk monster met laboratorium tape. Verzamel verschillende steekproeven per perceel zodat zij representatief voor de bevolking van de plant zijn. Gebruik van de dezelfde sampler voor het hele experiment en opnemen van het gebied dat elk monster aangeeft voor het berekenen van stolonen en rizoom dichtheid.Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de monsters kunnen worden opgeslagen in plastic zakken en bewaard bij een temperatuur van minder dan-18 ° C. 2. het reinigen van de biomassa monsters Leg het monster in een grote zeef met 0,5-1,5 mm openingen afhankelijk van de grootte van stolonen- of wortelstok. De openingen moet klein genoeg om te behouden alle vegetatieve en wortelstokken, maar groot genoeg om te laten gronddeeltjes te worden verwijderd. Voor zandige bodems kunnen beide zeven met verschillende openingen, geplaatst op de top van de andere, voor een betere nauwkeurigheid en efficiëntie. Reinig de monsters met een stroom van water met voldoende om gronddeeltjes te verwijderen zonder schade aan de planten. Ophalen van de schoongemaakte monsters en plaats ze in een lade met papieren handdoeken, verzorgen aan het label van de lade naar behoren.Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de monsters kunnen worden opgeslagen in plastic zakken en bewaard bij een temperatuur van minder dan-18 ° C. Reinig de monsters verder door het verwijderen van wortels en bladeren met een schaar. Tijdens dit proces, aparte vegetatieve en wortelstokken, indien nodig, en opnemen van aanvullende informatie zoals het aantal planten, geintroduceerd en vegetatieve per plant.Opmerking: Het verwijderen van alle wortel en blad weefsel uit de vegetatieve en wortelstokken precisie zal verbeteren. Fijne wortels zijn moeilijk te verwijderen; via de digitale beeldanalyse, het is echter mogelijk om hen uit de analyse met behulp van een software-applicatie die worden uitgesloten van de organen met een diameter van minder dan een gekozen waarde weglaten (zie stap 5.1), die is omschreven vrij nauwkeurig op basis van opmerkingen van beelden gereproduceerd op het scherm. Plaats vegetatieve en wortelstokken in papier label zakken.Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de monsters kunnen worden opgeslagen in plastic zakken en bewaard bij een temperatuur van minder dan-18 ° C. 3. scannen en afbeeldingen van de analyse van monsters Leg het monster op een transparante kunststof dienblad van de WinRHIZO-standaard scannen apparatuur. De vegetatieve en wortelstokken laboratorium pincet met minimaliseren overlappende handmatig te plaatsen. Grote monsters moeten mogelijk worden onderverdeeld in deelmonsters. Voeg geen water naar de schenkblad (zoals aanbevolen voor wortels), omdat de vegetatieve en wortelstokken voldoende stijfheid hebben te voorkomen dat buitensporige nabijheid van organen die kan leiden tot fouten van de lezing, die meestal met fijne wortels gebeurt. Plaats de lade op de ondergrond van de scanner. Zet de scanner en start u het programma uitvoert. Controleer dpi van de afbeelding in het menu beeld , opdracht afbeelding overname parameter, voor een mogelijke verdere controle in de opgeslagen afbeelding. Controleer drempel in analyse, wortel & achtergrond onderscheid, opdracht voor goede indeling van de pixel die behoren tot de gescande organen. Controleer dat de hele lade oppervlak wordt gescand in het menu beeld , opdracht afbeelding overname parameter. Controleer diameter klasse weergegeven voor organen distributie per diameter, in het grafische gebied boven de gescande afbeelding. Selecteer 20 gelijke breedte klassen met 0,1 mm intervallen door te klikken op de horizontale as van de grafiek. Met deze functie kunt uitsluiting van gegevens die behoren tot de wortels of kleine organen, wanneer vegetatieve of wortelstokken niet perfect waren schoongemaakt. De literatuur meldt dat de meeste wortels van gras soorten diameter lager dan 0,2 mm hebben.Opmerking: Breedte en aantal klassen kunnen worden aangepast rekening houdend met de gemiddelde diameter van vegetatieve en wortelstokken voor de geanalyseerde monsters en de variabiliteit rond dit gemiddelde. Een besturingselement moet worden uitgevoerd in sommige monsters om te bepalen van de minimale diameter worden uitgesloten. Voert het eerste monster scannen om te controleren dat de bewerking voor een goede analyse zorgt. Volg de instructies van de software voor het opslaan van de afbeelding en analyse verwerkt. Het beeld en de analyse van een label met het monster-label. Ga verder met het scannen van alle monsters.Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de monsters kunnen worden opgeslagen in plastic zakken en bewaard bij een temperatuur van minder dan-18 ° C. 4. meting van de droge stof Plaats de gescande monsters met een nauwkeurige elektronische evenwicht in een getarreerde aluminium lade. Herhaal stap 4.1 voor alle gescande monsters. Plaats alle de monsters in een oven, ingesteld op 105 ° C en droog ze gedurende 24 uur. Verwijderen van de monsters en wacht totdat het weefsel gewicht gestabiliseerd. Weeg alle monsters met hun tarra. Aftrekken van de tarra van het geregistreerde gewicht te verkrijgen van het nettogewicht van elk monster. 5. correctie van gegevens en de berekening van de lengte en gewicht dichtheid Correctie voor lengte en diameter van de gemiddelde Het txt-bestand als gevolg van de analyse met WinRHIZO naar een CSV-bestand converteren. Gebruik de resultaten gegroepeerd voor diameter klassen om te sluiten van gegevens van organen kleiner dan 0,2 mm (wortels, onderdeel van bladeren of krassen op de lade). Voor elke WinRHIZO lezen (rijen van txt-bestand) som alle lengtes nam voor klassen van de diameter groter is dan 0,2 mm. De lengte berekend met deze correctie wordt de effectieve lengte moet worden gebruikt voor verdere verwerking van de gegevens. Voor elke WinRHIZO lezing klassen som de projectie gebieden voor een doorsnede van opgenomen meer dan 0,2 mm. De verhouding tussen lengte en projectie gebied geeft de gemiddelde diameter gecorrigeerd voor uitsluiting van organen met een diameter minder dan 0,2 mm. Als het monster is opgesplitst in deelmonsters, de definitieve lengte berekend als de som van alle deelmonster lengtes en berekenen van de definitieve gemiddelde diameter als de verhouding tussen de som van alle deelmonster lengtes en de som van alle deelmonster projectie gebieden. Indien nodig, bereken de dichtheid van de lengte en gewicht per oppervlakte-eenheid gebaseerd op steekproefgrootte. Gebruik de gegevens die zijn verkregen voor de statistische analyse.

Representative Results

Een veld experiment werd opgericht in het najaar van 2013 te vergelijken stolonen en rizoom ontwikkeling van vier bermudagrass cultuurvariëteiten, met inbegrip van twee geplaatste soorten (“LaPaloma” en “Yukon”) en twee steriele vegetatieve hybriden (“Patriot” en “Tifway”). Het experimentele ontwerp was een gerandomiseerde volledige blok met drie replicaties, voor een totaal van 12 percelen (2 x 2 m). Veertien vegetatieve en veertien wortelstokken van elke cultivar gras-type en de wilde bermudagrass werden willekeurig verzameld in de percelen, maar ook van wild bermudagrass planten die groeien in de buurt van de percelen, voor een totaal van 70 vegetatieve en 70 wortelstokken. Alle vegetatieve en wortelstokken werden schoongemaakt zoals beschreven in het protocol (stap 2) voor verdere meting. Interneren diameter en lengte werden gemeten met een schuifmaat en liniaal, respectievelijk, en het aantal knooppunten werd geteld voor elke stolonen of wortelstok. De tijden moet schoon en stolonen en rizoom monsters meten met de liniaal en remklauw werden ook geregistreerd. Stolonen en rizoom diameters werden berekend als de middelen van alle stengellid diameters gemeten. Totale stolonen en totale rizoom lengtes werden berekend als de som van alle lengtes van de interneren. Anderzijds totaal gescand lengtes en gescande diameters van elke stolonen en rizoom werden gemeten met behulp van een digitaal beeld-analyse-systeem, zoals beschreven in stap 3 en 5. De tijden moet stolonen en rizoom eigenschappen meten door het digitale analysesysteem werden geregistreerd. Elke stolonen en rizoom waren knip met een schaar te scheiden van de groeispurt van knooppunten en de stengelleden werden gebruikt voor het schatten van de diameter van de gescande stengellid zoals beschreven in stap 3 en 5. Pearson’s correlatiecoëfficiënten werden berekend voor vegetatieve en wortelstokken (n = 70 vegetatieve, n = 70 wortelstokken) tussen gemeten en gescand lengtes, gemeten en gescand diameters, aantal knooppunten en de absolute waarde van het verschil tussen de gemeten en gescande diameters, en gemeten diameters en gescande stengellid diameters. De lengte gemeten met de liniaal werden gebruikt om de lengtes geschat via het systeem voor de analyse van digitaal beeld kalibreren. De regressie-analyse een hoge correlatie tussen stolonen gescand lengte en gemeten lengte (Figuur 1a), met een helling van 1.03 en het snijpunt van-4.22, alsmede tussen de lengte van de wortelstok gescand en gemeten lengte (Figuur 1b), aangeduid met een helling van 1.03 en het snijpunt van 4.22. Reinigen met de hand, 14 vegetatieve en 14 wortelstokken nam een gemiddelde tijd van 21 min 24 11 min en s en 12 s, respectievelijk. De gemiddelde tijd tot maatregel lengte en diameter met een liniaal en remklauw was 14 min en 6 s voor vegetatieve en 13 min en 35 s voor wortelstokken. De analyse van monsters met WinRHIZO scannen en software nam een gemiddelde van 11 min voor vegetatieve en 12 min en 4 s voor wortelstokken. Gemeten en gescande diameters waren ook significant gecorreleerd in zowel de vegetatieve en de wortelstokken. De relaties tussen gemeten en gescande diameter waren dicht bij 1:1, met vermelding van een goede pasvorm van de gegevens (Figuur 2a en 2b). Echter het snijpunt aangegeven dat digitaal beeld analysesysteem overschat gemeten doorsnede, speciaal voor lagere waarden, en dat hogere waarden met de diameter van de wortelstok werden onderschat. Deze overschatting kan worden veroorzaakt door stolonen-knooppunten die door de software, waardoor de totale projectieoppervlak dat wordt gebruikt voor de berekening van de diameter zijn gescand (verhouding tussen totale projectieoppervlak en de totale lengte), en in plaats daarvan worden uitgesloten wanneer metingen gemaakt met de remklauw. De correlatie tussen het aantal knooppunten en verschil tussen diameter waarden, verkregen door beide methoden (gemeten en gescand) was significant alleen in vegetatieve (Figuur 3a); variaties in het aantal knooppunten verklaarde ook, slechts een klein deel van de variatie van dit verschil (R2 = 14%). De significante correlatie gevonden tussen gescand stengellid diameter en gemeten diameter (hellingen van 1.01 en 0,98 voor vegetatieve en wortelstokken, respectievelijk; onderschept van bijna nul) (figuur 4a en 4b) toont aan dat stengellid diameter nauwkeurig geschat worden via het systeem voor de analyse van digitaal beeld zolang de knooppunten verwijderd. Dus kan totale stolonen lengte en gemiddelde diameter van monsters gecomponeerd door talrijke vegetatieve of wortelstokken worden gemakkelijk en nauwkeurig gekwantificeerd met behulp van het systeem van de analyse van de digitale afbeelding. Als onderdeel van een lopende experiment, één turf monster (20 x 20 x 15 cm diepte) verzameld in ieder waarnemingspunt seizoeninvloeden vanaf najaar 2013 voor zomer 2015 was en werd behandeld zoals beschreven in het protocol. De lengte van de stolonen en rizoom per oppervlakte-eenheid (lengte dichtheid) en het gewicht per eenheid oppervlakte (gewicht dichtheid) van monsters die in juli 2014 worden gepresenteerd in Figuur 5. Verschillen in dichtheid van stolonen lengte tussen de vegetatief gekweekte cultivars (“Patriot” en “Tifway”) werden waargenomen en ontpit ones (“La Paloma” en “Yukon”). “Patriot” weergegeven de hoogste rizoom lengte dichtheid, gevolgd door “Tifway” en de geplaatste cultivars. De dichtheid van stolonen gewicht was anders voor alle cultivars, met “Patriot” toont de hoogste waarde gevolgd door “Tifway”, “La Paloma” en “Yukon”. De vegetatief gekweekte cultivars weergegeven ook hogere dichtheden van rizoom gewicht dan de geplaatste cultivars. De ontwikkeling van stolonen en rizoom lengte per oppervlakte-eenheid (lengte dichtheid) en het gewicht per eenheid oppervlakte (gewicht dichtheid) van cultivar Patriot gedurende de studieperiode worden gerapporteerd in Figuur 6. Stolonen lengte dichtheid weergegeven een stijging vanaf maart 2014 tot juli 2014, en het deed niet variëren van juli 2014 tot juli 2015. Alleen een paar wortelstokken werden gevonden in de monsters die in oktober 2013 en maart 2014. Wortelstok lengte dichtheid stegen in juli 2104, bereikt haar hoogste waarden, maar verminderde opnieuw in oktober 2014. Stolonen gewicht dichtheid lichtjes gestegen van maart tot juli 2014; echter werd meer toenam waargenomen van juli tot oktober 2014, met een daaropvolgende daling in maart 2015. Wortelstok gewicht dichtheid had een soortgelijke trend rizoom lengte dichtheid, met de hoogste waarde in juli 2014. De software bevat in de analyse van alle objecten in de gescande afbeelding. Een voorbeeld van een digitaal beeld analyse lay-out van WinRHIZO software wordt gepresenteerd (Figuur 7), waar de lijnen van verschillende kleur overlay objecten (vegetatieve) met verschillende diameter te berekenen van de totale lengte per diameter klasse. We kunnen constateren dat de analyse rekening fragmenten van wortels houdt of bladeren. Zoals beschreven in de stap 3.9, is het mogelijk om de breedte en het aantal diameter klassen die zijn geanalyseerd te beperken. Het histogram toont de verdeling van de lengtes in de diameter van de geselecteerde klassen (Figuur 7). Dit histogram kan worden gebruikt ter beoordeling van de minimumdiameter klassen worden uitgesloten. Een visuele waarneming van deze grafiek in het bovenste gedeelte van de hoogtepunten van het scherm beeld dat de lengte heeft een normale verdeling rond een gemiddelde bedoel diameter klasse, met uitzondering van de eerste twee klassen die hogere waarden dan de montage van de normale weergeven distributie. Zelfs als monsters zorgvuldig gereinigde, met inbegrip van deze kleinere klassen, gegevensanalyse invloed kan zijn op de resultaten, overschatting van de dichtheid van de lengte en het onderschatten van gemiddelde diameter. Onze resultaten tonen aan dat de lengte van kleinere klassen (diameter < 0.2 mm) 13-32% van de totale rizoom lengte waarden die voortvloeien uit de analyse van de software (tabel 1). Bovendien was de gemiddelde diameter onderschat van 2-17% (tabel 1). Figuur 1: Regressie-analyse van lengte waarden gemeten met de liniaal tegen waarden geschat met het systeem van de analyse van het digitale beeld van bermudagrass vegetatieve24 (a) en) wortelstokken (b). De onderbroken lijn geeft een 1:1 verhouding. Deelvenster A is gewijzigd van Pornaro et al. 24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: Regressie-analyse van diameter waarden gemeten waarden met de remklauw geschat met het systeem van de analyse van het digitale beeld van bermudagrass vegetatieve24 (a) en wortelstokken (b). De onderbroken lijn geeft een 1:1 verhouding. Deelvenster A is gewijzigd van Pornaro et al. 24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: Regressie-analyse van aantal knooppunten van bermudagrass vegetatieve24 (a) en (b) tegen de absolute waarden van verschil tussen diameter wortelstokken geschat met het systeem van de analyse van het digitale beeld en gemeten met de remklauw. De onderbroken lijn geeft een 1:1 verhouding. Deelvenster A is gewijzigd van Pornaro et al. 24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 4: Regressie-analyse van diameter waarden gemeten waarden met de remklauw geschat met het digitaal beeld analysesysteem van bermudagrass vegetatieve24 (a) en wortelstokken (b) voor de groeispurt alleen. De onderbroken lijn geeft een 1:1 verhouding. Deelvenster A is gewijzigd van Pornaro et al. 24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 5: voorbeeld resultaten van lengte en gewicht dichtheid van vegetatieve en wortelstokken uit een veld-proef vergelijken vier gazonnen bermudagrass cultivars (Patriot, Tifway, La Paloma, Yukon). Stolonen lengte dichtheid (a), rizoom lengte dichtheid (b), stolonen gewicht dichtheid (c) en rizoom gewicht dichtheid (d). Verticale staven standaardfouten van zes wordt gerepliceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 6: voorbeeld resultaten van lengte en gewicht dichtheid van vegetatieve en wortelstokken uit een veld-proef tonen stolonen en rizoom ontwikkeling van Patriot bermudagrass cultivar. Stolonen lengte dichtheid (a), rizoom lengte dichtheid (b), stolonen gewicht dichtheid (c) en rizoom gewicht dichtheid (d). Verticale staven standaardfouten van zes wordt gerepliceerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 7: voorbeeld indeling van digitale beeldanalyse van software WinRHIZO. De gescande afbeelding in de voorgrond en de staafdiagrammen in het bovenste gedeelte van het beeld tonen de lengte verdeling in de diameter van de geselecteerde klassen. De gekleurde lijnen geven de beeldanalyse en elke kleur correspondeert met kleuren van diameter klassen gemeld in de staafdiagrammen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Cultivar Blok Wortelstok lengte (cm/dm2) Gemiddelde diameter (mm) < 0,2 mm totaal verhoudingeen < 0,2 mm totaal verhoudingb Patriot 1 231 278 16,9 1.637846 1.5994 97,7 Patriot 2 304 349 12,8 1.620667 1.588371 98,0 Patriot 3 304 366 16,8 1.649918 1.621367 98,3 Tifway 1 184 231 20,6 2.149745 1.9951 92,8 Tifway 2 155 193 19,9 1.866253 1.76605 94,6 Tifway 3 119 150 20,9 1.877386 1.75865 93,7 La Paloma 1 17 23 24.4 2.139019 1.8904 88,4 La Paloma 2 26 38 31,6 2.101385 1.7455 83,1 La Paloma 3 34 47 27,5 2.033729 1.7354 85,3 Yukon 1 32 44 28,0 1.700155 1.4945 87.9 Yukon 2 17 25 33.2 1.68339 1.4284 84,9 Yukon 3 67 87 23,6 1.844721 1.6774 90,9 een lengte van klassen ≤0.2 mm/totale lengte b totale doorsnede/diameter van klassen ≤0.2 mm Tabel 1: rizoom lengte dichtheid en rizoom gemiddelde diameter met en zonder kleinere diameter klassen. Lengte dichtheid met en zonder inclusief diameter klassen kleiner dan 0,2 mm en hun ratio’s (lengte van klassen ≤ 0.2 mm/totale lengte); en gemiddelde diameter met en zonder inclusief diameter klassen kleiner dan 0,2 mm en hun ratio’s (diameter inclusief klassen < 0,2/diameter zonder diameter klassen < 0.2 mm).

Discussion

Het hier beschreven protocol werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de studie van turfgrasses. Echter kan het worden gebruikt over een bereik van stoloniferous of vaste soorten met nodige aanpassingen volgens hun morfologische kenmerken, omgevingsfactoren en monster schoonmaken precisie.

De gemiddelde diameter geschat door middel van dit protocol worden niet vergeleken met de diameter van de stengellid gemeten met een remklauw. De digitale beeldanalyse omvat knooppunten en groeispurt in de berekening van de gemiddelde diameter, dat is de verhouding tussen de totale projectieoppervlak en de totale lengte. Zoals besproken door Pornaro et al. ²⁴, gemiddelde diameter verkregen voor bermudagrass vegetatieve met WinRHIZO systeem overschat gemiddelde diameter waarden gemeten met de remklauw op de interneren. Stolonen diameter wordt meestal gebruikt voor het beschrijven van de diameter van stolonen stengelleden en is een gemeenschappelijke parameter die wordt gebruikt voor Botanische beschrijving¹⁸^,²⁵. Om deze reden, Pornaro et al. ²⁴ wees erop dat de gemiddelde diameter via WinRHIZO systeem geschat en de handmatig gemeten stengellid diameter beschrijven twee verschillende morfologische aspecten.

De tijd die nodig is voor het uitvoeren van dit protocol blijft een beperkende factor voor routine analyse. De meest tijdrovende fase is de reiniging van de monsters (stap 2.4). Gebaseerd op onze ervaring, reiniging van één turf monster met een grote hoeveelheid biomassa (dat wil zeggen, 20 x 20 cm) vereist ongeveer drie mensen die werken voor 2 tot 4 uur. Zoals beschreven in het protocol, is het reinigingsproces noodzakelijk voor zowel de digitale analysesysteem en bij het gebruik van de remklauw en de liniaal. Wanneer monsters bestaan uit een beperkt aantal vegetatieve/wortelstokken, is de tijd die nodig is om gegevens te verzamelen met het gemakkelijkst vergelijkbaar. Echter, zoals steekproefgrootte wordt verhoogd, de software gebaseerde methode beschikt niet over een latere tijd te verhogen, als de enige beperkende factor de oppervlakte van de scanner is. Integendeel, de tijd die nodig is voor het meten van organen met de liniaal en remklauw neemt toe met het aantal vegetatieve of wortelstokken samenstellen van het monster.

De studie voor stolonen en rizoom traits in volwassen turfgrasses heeft altijd gebaseerd geweest op de meting van interneren lengte en diameter en massa droog gewicht⁷^,¹¹^,²⁶^,²⁷. Als gevolg van de grote tijd die nodig is voor het verwerken van monsters en de afname van de nauwkeurigheid met de toename van de steekproefomvang, moeten handmatige metingen worden beperkt tot een klein aantal vegetatieve of wortelstokken¹¹^,²⁰^,²⁵. Als zodanig kunnen alleen zij geschikt voor experimenten met single-planten. Het voordeel van het systeem van de analyse van een afbeelding ten opzichte van traditionele methoden is dat dat kan meten de lengte van grote stolonen of wortelstok monsters en bereken zowel lengte dichtheid en soortelijk gewicht (gewicht-lengte verhouding).

Dit protocol voorziet in het meten van stolonen en rizoom lengte en berekening van de lengte dichtheden in monsters met grote biomassa (waarvoor stolonen-of wortelstok gewicht is momenteel de enige parameter die wordt gebruikt voor de beschrijving van de morfologie). Stolonen en/of wortelstok lengte mogelijk een belangrijke parameter in vele studies die met de huidige technieken kan niet worden geschat. Recente studies over verschillende gras soorten⁶ hebben aangetoond dat stolonen gewicht en lengte dichtheden zijn niet altijd gecorreleerd, die aangeeft dat het wenselijk zijn kan te meten van meerdere parameters worden gebruikt voor het stolonen en rizoom systeem naar behoren te beoordelen. Deze methode moet met name geschikt voor cultivar of cultureel management praktijken vergelijking.

Verschillende stappen in het protocol zijn cruciaal voor een succesvolle schatting van de lengte en de gemiddelde diameter van vegetatieve en wortelstokken. Vanwege de hoge variabiliteit van plant morfologie onder verschillende milieuvoorwaarden, het aantal monsters (de grootte van de steekproef) en grondoppervlak dimensies die moeten worden bemonsterd (monster dimensie) moet zorgvuldig worden beoordeeld en worden zo representatief mogelijk zijn voor de bevolking teneinde de variabiliteit van de gegevens. Bovendien, schoonmaak wortels en vertrekt vanuit de vegetatieve voordat analyse zorgvuldige werk vereisen speciale aandacht is aan het voorkomen van overestimations. Tot slot, alvorens beelden te verwerken, is het aanbevolen om zorgvuldig Selecteer de breedte van diameter klassen en minimum diameter met behulp van softwareopties uit te sluiten van alles dat is niet een stolonen of de wortelstok van de analyse. Elk experiment vereist de selectie met een minimale diameter, zoals diameter afhankelijk van soort en milieuomstandigheden, met inbegrip van de culturele praktijken.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Geen.

Materials

laboratory tape	Any	NA	Tags may be used to label samples
plastic bags	Any	NA	Any plastic bag can be used to keep samples until they have been cleened
paper bags	Any	NA	Any paper bag can be used to keep cleaned samples to avoid mold formation
paper towels	Any	NA	After samples have been washed with water and before to clean them with scissors it is helpful to put them on a paper towel to absorb water
scissor	Any	NA	Any scissor with fine tips
aluminium box	Any	NA	Any aluminium box large enough to contain the sample
trays	Any	NA	It is helpful to use plastic tray to hold samples during the cleaning process
sieve with 0.5-1.5 mm openings	Any	NA	Any sieve
soil core sampler	Any	NA	We use core sampler for soil collection with diameter of at least 8 cm
squared frame	Any	NA	To collect large samples we use squared frame (10 x 10 cm, or 15 x 15 cm, or 20 x 20 cm)
spade	Any	NA	We use spade to pull out samples delimited with squared frame
precision electronic balance	Any	NA	Any precision electronic balance
laboratory oven	Any	NA	Any laboratory oven
freezer	Any	NA	Any freezer
WinRHIZO software	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	Excluded the "basic" version
WinRHIZO scanner	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	WinRHIZO system includes a scanner calibrated for the software
WinRHIZO scanner accessories	Regent Instruments Inc., Quebec	NA	WinRHIZO system includes accessories, as plastic tray and positioner, to be used with the scanner

References

Beard, J. B. . Beard’s turfgrass encyclopedia for golf courses, grounds, lawns, sports fields. , (2004).
Anderson, J. A., Taliaferro, C. M., Wu, Y. Q. Freeze tolerance of seed- and vegetatively propagated bermudagrasses compared with standard cultivars. Applied Turfgrass Science. , (2007).
Gennaro, P., Piazzi, L. The indirect role of nutrients in enhancing the invasion of Caulerpa racemosa var cylindracea. Biological Invasions. 16 (8), 1709-1717 (2014).
Ortiz-Ribbing, L. M., Eastburn, D. M. Evaluation of digital image acquisition methods for determining soybean root characteristics. Crop Management. , (2003).
Pornaro, C., Schneider, M. K., Leinauer, B., Macolino, S. Above-and belowground patterns in a subalpine grassland-shrub mosaic. Plant Biosystems. 151 (3), 493-503 (2017).
Pornaro, C., Menegon, A., Macolino, S. Stolon development in four turf-type perennial ryegrass cultivars. Agronomy Journal. , (2018).
Rimi, F., Macolino, S., Richardson, M. D., Karcher, D. E., Leinauer, B. Influence of three nitrogen fertilization schedules on bermudagrass and seashore paspalum: II. Carbohydrates and crude protein in stolons. Crop Science. 53, 1168-1178 (2013).
Schiavon, M., Macolino, S., Leinauer, B., Ziliotto, U. Seasonal changes in carbohydrate and protein content of seeded bermudagrasses and their effect on spring green-up. Journal of Agronomy and Crop Science. 202 (2), 151-160 (2016).
Macolino, S., Ziliotto, U. Comparison of Turf Performance and Root Systems of Bermudagrass Cultivars and Companion Zoysiagrass. Acta Horticulturae. 938, 185-190 (2012).
Giolo, M., Macolino, S., Barolo, E., Rimi, F. Stolons reserves and spring green-up of seeded bermudagrass cultivars in a transition zone environment. HortScience. 48 (6), 780-784 (2013).
Lulli, F., et al. Physiological and morphological factors influencing wear resistance and recovery in C3 and C4 turfgrass species. Functional Plant Biology. 39, 214-221 (2012).
Ramalingam, P., Kamoshita, A., Deshmukh, V., Yaginuma, S., Uga, Y. Association between root growth angle and root length density of a near-isogenic line of IR64 rice with DEEPER ROOTING 1 under different levels of soil compaction. Plant Production Science. 20 (2), 162-175 (2017).
Qin, R., Noulas, C., Herrera, J. M. Morphology and Distribution of Wheat and Maize Roots as Affected by Tillage Systems and Soil Physical Parameters in Temperate Climates: An Overview. Archives of Agronomy and Soil Science. , 1-16 (2017).
Barnes, B. D., Kopecký, D., Lukaszewski, A. J., Baird, J. H. Evaluation of turf-type interspecific hybrids of meadow fescue with perennial ryegrass for improved stress tolerance. Crop Science. 54, 355-365 (2014).
Biernacki, M., Bruton, B. D. Quantitative response of Cucumis melo inoculated with root rot pathogens. Plant Disease. 85, 65-70 (2001).
Bouma, T. J., Nielsen, K. L., Koutstaal, B. Sample preparation and scanning protocol for computersied analysis of root length and diameter. Plant and Soil. 218, 185-196 (2001).
Kraft, J. M., Boge, W. Root characteristics of pea in relation to compaction and Fusarium root rot. Plant Disease. 85, 936-940 (2000).
Rimi, F. . Performance of warm season turfgrasses as affected by various management practices in a transition zone environment. , (2012).
Burgess, P., Huang, B. Growth and physiological responses of creeping bentgrass (Agrostis stolonifera) to elevated carbon dioxide concentrations. Horticulture Research. 1, 14021 (2014).
Volterrani, M., et al. The Effect of Increasing Application Rates of Nine Plant Growth Regulators on the Turf and Stolon Characteristics of Pot-grown ‘Patriot’ Hybrid Bermudagrass. HortTechnology. 25 (3), 397-404 (2015).
Böhm, W. Methods of studying root systems. Ecological studies: Analysis and synthesis. , 64-71 (1979).
Box, J. E. Modern methods for root investigations. Plant Roots: The Hidden Half. , 193-237 (1996).
Dowdy, R. H., Nater, E. A., Dolan, M. S. Quantification of the length and diameter of root segments with public domain software. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26, 459-468 (1995).
Pornaro, C., Macolino, S., Menegon, A., Richardson, M. WinRHIZO Technology for Measuring Morphological Traits of Bermudagrass Stolons. Agronomy Journal. 109 (6), 3007-3010 (2017).
Taliaferro, C. M., Martin, D. L., Anderson, J. A., Anderson, M. P. Patriot turf bermudagrass. United States Plant Patent. , (2006).
Munshaw, G. C., Williams, D. W., Cornelius, P. L. Management strategies during the establishment year enhance production and fitness of seeded bermudagrass stolons. Crop Science. 41, 1558-1564 (2001).
Rimi, F., Macolino, S., Richardson, M. D., Karcher, D. E., Leinauer, B. Influence of three nitrogen fertilization schedules on bermudagrass and seashore paspalum: I. Spring green-up and fall color retention. Crop Science. 53, 1161-1167 (2013).
Murphy, S. L., Smucker, A. J. M. Evaluation of video image analysis and line-intercept methods for measuring root systems of alfalfa and ryegrass. Agronomy Journal. 87, 865-868 (1995).
Wright, S. R., Jennette, M. W., Coble, H. D., Rufty, T. W. Root morphology of young Glycine max, Senna obtusifolia, and Amaranthus palmeri. Weed Science. 47, 706-711 (1999).
Nilsson, H. E. Remote sensing and image analysis in plant pathology. Annual Review of Phytopathology. 15, 489-527 (1995).
Ottman, M. J., Timm, H. Measurement of viable plant roots with the image analyzing computer. Agronomy Journal. 76, 1018-1020 (1984).
Newman, E. I. A method of estimating the total length of roots in a sample. Journal of Applied Ecology. 3, 139-145 (1966).
Tennant, D. A test of a modified line intersect method of estimating root length. Journal of Ecology. 63, 995-1001 (1975).
Arsenault, J. L., Pouleur, S., Messier, C., Guay, R. WinRHIZO™, a root-measuring system with a unique overlap correction method. HortScience. 30, 906 (1995).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Pornaro, C., Macolino, S., Richardson, M. D. Measuring Stolons and Rhizomes of Turfgrasses Using a Digital Image Analysis System. J. Vis. Exp. (144), e58042, doi:10.3791/58042 (2019).