Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la extracción de ácidos nucleicos de virus rápido de la sangre virus inactivado. La extracción se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad. El método no es dependiente de laboratorios y puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales).
Abstract
El diagnóstico rápido de infección es esencial para el manejo de brote, contención del riesgo y atención al paciente. Previamente hemos demostrado un método para la rápida inactivación cabecera del virus Ebola durante la muestra de sangre para las pruebas de ácido nucleico seguro (NA) mediante la adición de un tampón de lisis/enlace comercial directamente en los tubos de colección de sangre vacío. Usando este método de inactivación de cabecera, hemos desarrollado un seguro, rápido y simplificado cabecera NA método de extracción para la posterior detección de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. La extracción de NA se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad.
Después se recoge la sangre en el buffer de lisis/vinculante, el contenido se mezcla poniendo el tubo con la mano, y la mezcla se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. Partículas de vidrio magnético (MGP) se agregan al tubo, y los contenidos son mezclados por el tubo de recogida de los bancos a mano. Los pop son recogidos luego en el lado del tubo de la colección de sangre utilizando un soporte magnético o un imán y una banda de caucho. El pop se lavan tres veces, y después de la adición de tampón de elución directamente en el tubo de colección, NAs están listos para pruebas de NA, como qPCR o amplificación isotérmica lazo (lámpara), sin el retiro de los pop de la reacción. El método de extracción de NA no es dependiente en las instalaciones de laboratorio y puede fácilmente ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales y salas de aislamiento del hospital). Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento portátil, puede obtenerse un diagnóstico dentro de 40 min de la colección de sangre.
Introduction
En situaciones de brote de virus, cuando los pacientes están confinados a las salas de aislamiento del hospital o cuando se necesita un rápido diagnóstico, una diagnosis molecular del punto de atención de segura, sencilla y precisa es imprescindible para la contención del cuidado y el riesgo del paciente. Dos brotes recientes virales del virus de Ebola (EBOV) en África del oeste (2013) y el virus Zika en América del Sur (2015), han aumentado el interés en el mayor punto de atención moleculares pruebas diagnósticas, como isotérmico de reversa de la transcripción mediada por el lazo amplificación (RT-LAMP)1,2 y recombinase polimerasa amplificación (RPA)3,4. RT-LAMP y RPA son rápidas, sensibles y específicas pruebas moleculares que pueden realizarse sobre los preparativos de la muestra simplificada. Para el virus Zika, RT-LAMP se ha combinado con un análisis de flujo lateral (LFA), que puede detectar el virus Zika en muestras de sangre no purificados dentro de 30 min1; sin embargo, para EBOV, que está clasificado como un patógeno del grupo 4 de riesgo y es altamente contagiosa, las muestras necesitan manejarse bajo bioseguridad nivel 4 (BSL-4) condiciones e inactivado antes de cualquier procedimiento diagnóstico seguro se puede realizar.
Se utilizaron métodos de inactivación simplificada de EBOV, tales como la adición de buffer de lisis a la muestra de2,3,4,5, durante el brote; sin embargo, estos métodos requieren un manejo bajo condiciones BSL-4 con equipo de laboratorio, tales como gabinetes de bioseguridad BSL-3, centrifugadoras, bloques de calentamiento y pipetas, en un mínimo. Este equipo normalmente no está presente en salas de aislamiento o en hospitales. Para superar este reto, se ha intentado realizar diagnósticos en maletas3, y varios dispositivos portátiles y las máquinas han sido desarrolladas [por ejemplo, un dispositivo portátil para la extracción de ácidos nucleicos (NA)]6. Sin embargo, las muestras positivas de EBOV aún necesitan ser inactivado antes de que estos dispositivos se pueden utilizar.
Hemos divulgado previamente un método de inactivación de virus rápido de cabecera de EBOV7, virus de la Vaccinia y vacuna virus8 por adición de un tampón de lisis/enlace comercial para tubos para colección de sangre vacío ordinario, lo que permite la directa transferencia de sangre del paciente en la inactivación buffer7. Esta inactivación directa e inmediata en un sistema cerrado elimina la necesidad para el manejo de las muestras utilizando cualquier contención rigurosa, como BSL-4 condiciones7, y las muestras pueden ser manejadas bajo condiciones normales de BSL-2. Este método de inactivación es compatible con varios sistemas de extracción de NA, como robots y kits de purificación7de mano; sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio, tales como robots, centrifugadoras y la electricidad, que no siempre están presentes sobre el terreno o dentro de pabellones de aislamiento hospitalarios.
En este informe, describimos un seguro, rápido y simplificado NA extracción método manual para la posterior detección molecular de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/obligatorio. El método de extracción de NA no requiere cualquier dispositivo distinto de un imán magnético soporte. No centrifugadoras, bloques, o la electricidad de la calefacción son necesarios para la extracción de NA. Por lo tanto, este método no es dependiente de laboratorios y fácilmente puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales, en las salas de aislamiento del hospital, o con escasos recursos). El método de extracción de NA es rápida y sencilla y puede ser utilizado directamente en pruebas NA aguas abajo, como qPCR, RT-qPCR, lámpara, lámpara de RT. Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento isotermo portátil impulsado por batería, puede obtenerse un diagnóstico cabecera dentro de 40 min de la colección de sangre.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este informe, describimos un seguro, rápido y simple cabecera NA extracción método manual para la detección molecular aguas abajo de un virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. El método de extracción descrito NA fue desarrollado para llevar a cabo directamente en muestras de sangre recogidas en vacío sangre colección tubos la lisis/enlace buffer (Tabla de materiales)7. Este búfer específico inactiva EBOV7 y es el component…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen y Solvej Kolbjørn Jensen por su asistencia técnica y para el manejo de las muestras clínicas. Este proyecto forma parte del consorcio EbolaMoDRAD, que ha recibido financiación de la empresa de común innovadora medicina iniciativa 2 bajo subvención Convenio N ° 115843. Esta empresa común recibe el apoyo del investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y el programa de innovación y la EFPIA.
Materials
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
- MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).
