CRISPR guida RNA clonazione per sistemi mammiferi

Nota: Il seguente protocollo descrive come eseguire gRNA progettazione utilizzando gli strumenti online (punti 1.1-1.4), che sono comuni a tutti i metodi di costruzione del plasmide gRNA dettagliati in questo manoscritto. Una volta identificati i gRNAs desiderata, passi per ordinare i oligonucleotides necessari sono descritte con diversi metodi per introdurre gli oligonucleotidi in vettori di espressione (ad esempio, pSB700). 2 metodi di clonazione singoli vettori esprimenti Guida basati su entrambi la legatura in un vettore di espressione predigerita (passi 2-7,3) o Golden Gate clonazione (passaggi 8-8.4) sono presentati. Ulteriormente delineato è una strategia per clonazione vettori esprimenti guida accoppiati usando reazione a catena della polimerasi (PCR) seguita da Golden Gate clonazione (passaggi 11-16). Infine, i metodi comuni per l’esecuzione di una trasformazione chimica di e. coli (passaggi 9-9.6) e convalida di un’espressione vettoriale sequenza (passaggi 10 a 10.2.3) inoltre sono descritti. Progettare oligonucleotidi gRNA utilizzando gli strumenti online come segue. GRNAs di progettazione utilizzando strumenti online come il sgRNA Scorer 2.0 strumento online (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 o alternative come lo strumento di progettazione di ampio sgRNA (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgRNA-progettazione)14 e parecchi altri15. Utilizzare il nome del gene, il simbolo o il crude sequenze bersaglio di DNA per generare potenziali gRNA sequenze.Nota: Viene creato un file di foglio di calcolo (.csv/.xls) con tutti i potenziali gRNAs contro il gene o la sequenza fornita. La qualità della gRNAs potenziale verrà segnalata come Punteggio se viene utilizzato lo strumento online sgRNA Scorer 2.0, o come efficienza obiettivo % se viene utilizzato lo strumento di progettazione sgRNA ampio. Entrambe le misure sono derivate basato sull’attività di taglio sul bersaglio. Considerare l’ attività Off-target nella selezione gRNA quando classifica i gRNAs.Nota: Guide ottimale sono quelli con la massima efficienza in target e l’attività di almeno fuori bersaglio. Per l’attivazione (CRISPRa), gRNAs sono progettati per raggiungere la regione da 1-200 bp a Monte del sito (TSS) inizio trascrizionale4,15. Per inibizione (CRISPRi), gRNAs sono progettati per raggiungere la regione da 50 bp a Monte del TSS fino a 300 bp a valle del TSS5. Per disattivare un gene usando il taglio del Cas9, gRNAs sono progettati per indirizzare il primo 10-50% della sequenza di codificazione a valle del codone (come gRNAs mirata all’estremità 3′ del gene sono stati indicati per essere meno efficace) d’inizio13. Garantire nessun siti BsmBI interni sono presenti se oligonucleotidi vengono utilizzati per la clonazione del Golden Gate, come questo si tradurrà nei oligonucleotides Ricotti essere digerito13. Selezionare le sequenze genomiche di destinazione e rimuovere il 3′ NGG PAM (lasciando solo la sequenza di protospacer) per la modifica di gRNA singolo oligonucleotide sequenza (ad esempio, sequenza di avvio: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).Nota: Se si utilizza un foglio di calcolo, la formula seguente rimuoverà 3′ NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), dove A2 è la cella che contiene la sequenza di destinazione e il PAM. Aggiungere CACCG all’estremità 5′ dell’oligo.Nota: Al momento di legatura per la spina dorsale pSB700, questa sequenza comprenderà estremità 3′ del promotore U6 guida la trascrizione del gRNA. La sequenza “CACC” assicura che l’oligo è compatibile con gli strapiombi del vettore pSB700 BsmBI-digerito. La “G” è un requisito dei promotori della polimerasi III e assicura l’efficiente avvio della trascrizione del gRNA. Utilizzare la seguente formula in un foglio di calcolo per eseguire questa operazione: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2)), dove B2 è la cella contenente la sequenza di protospacer [ad esempio, l’aggiunta di 5′ CACCG di sequenza per il protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (questo è il finale oligo avanti che è stato ordinato)]. Creare un complemento inverso (rc) della sequenza protospacer.Nota: per esempio, il complemento inverso del protospacer di cui sopra è TGGATGAGGGAGAGCACGCG. Aggiungere AAAC all’estremità 5′ della protospacer rc. Accodare un do all’estremità 3′ della protospacer rc (oligo inversa).Nota: La sequenza di “AAAC” assicura che l’oligo è compatibile per la clonazione nel vettore pSB700 BsmBI-digerito. Ulteriori “C” all’estremità 3′ è necessario per temprare la sequenza di avvio “G” aggiunto all’oligo avanti. Utilizzare la seguente formula in un foglio di calcolo per eseguire questo compito =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), dove C2 è la cella contenente la sequenza inversa complemento [ad es., AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (questo è il finale oligo inversa che è ordinato)]. Ordinare gli oligonucleotidi, senza ulteriori modifiche sui oligonucleotides. Ordinare la quantità minima di oligo richiesto, solo piccole quantità sono necessari per le reazioni di clonazione. Diluire il primer liofilizzati a una concentrazione finale di 100 μM in 1x buffer di TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 con 1 mM EDTA). Aliquotare 1:1 e inversione oligonucleotidi (ad esempio, 10 μL ciascuno) in provette per PCR striscia-cap.Nota: Questo permetterà la rapida clonazione di molti gRNAs alla volta usando una pipetta multicanale. Vortice e spin giù le miscele di oligo (100 x g per 15 s). Incubare la reazione a temperatura ambiente per 5 minuti prima di impostare la legatura.Nota: Non è necessario riscaldare e raffreddare quindi le miscele di oligo per facilitare loro ricottura. Vale la pena notare che 3-4 coppie di oligonucleotidi gRNA possono essere riunite e ricotto in una singola reazione (ad es., mix 3 μL di forward e 3 μL di reverse oligonucleotidi insieme da fino a 4 coppie di oligo gRNA, dando un volume totale di 24 μL). Il volume di oligonucleotidi utilizzati per la ricottura può essere regolato per soddisfare le esigenze di un utente.Nota: Passaggi 6-7.3 descrivono l’abbrevia di pSB700. Un metodo alternativo, vedere il passaggio 8, che descrive una legatura di restrizione BsmBI passo singolo. Digerire μg 1-5 del vettore di espressione selezionata pSB700 guida con BsmBI (0,5 μL a 1 μg) per 1 h a 55 ° C15. Condurre la digestione del vettore pSB700 gRNA espressione in un volume totale di 40 μL (tabella 1). Eseguire i prodotti di digestione su gel di agarosio 1.5% (wt/vol) basso punto di fusione. Tagliare la banda di spina dorsale di vettore digerito che corrisponde a un frammento di ~ 9 kb di dimensione e posizionare la fetta di gel in una microcentrifuga da 1,5 mL (Figura 1). Utilizzare un kit di purificazione del gel commerciale per estrarre il DNA dal gel dell’agarosi secondo le istruzioni del produttore. Eluire il DNA in 10-15 μL di tampone di TE (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) per ottenere un concentrato eluato. Legare i oligonucleotides ricotto gRNA dal passaggio 4 nel vettore di espressione di guida pSB700 BsmBI-digerito in una reazione di 20 μL (tabella 2) per la clonazione dei oligonucleotides gRNA nel vettore di espressione pSB700 pre-digeriti. In primo luogo, aggiungere acqua, buffer e DNA, poi vortice la miscela e aggiungere enzima, vortice finale 1 volta dopo aver aggiunto l’enzima e spin-down la soluzione (100 x g per 15 s). Incubare le reazioni a temperatura ambiente per una notte. Includere una reazione di controllo negativo no-inserto che dispone di un vettore BsmBI-digerita da sola, senza un inserto di oligo gRNA ricotto. 1 μL di acqua può essere utilizzato al posto di 1 μL di gRNA oligonucleotidi per il controllo negativo no-inserto. Procedere alla trasformazione (passo 9).Nota: Passaggio 8 è un metodo alternativo per l’abbrevia di pSB700 come descritto nei passaggi 6-7.3. Introdurre gRNA oligonucleotidi (descritti nei passaggi 1-5.1) il vettore pSB700 attraverso l’uso di Golden Gate clonazione per la legatura di restrizione BsmBI passo singolo. Assemblare il mix master (1x) — se più gRNAs sono da clonare, preparare il mix master senza i oligonucleotides di inserto aggiunti (tabella 3). Aliquotare il master mix in provette per PCR e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere i oligonucleotides gRNA dalla fase 4.2. Includere un controllo no-inserto utilizzando 1 μL di acqua. Includendo l’enzima BsmBI e T4 DNA ligasi entro la stessa reazione, digestione di limitazione simultanea e la legatura vengono raggiunti (cioè, Golden Gate clonazione). Utilizzare il seguente protocollo semplice cancello per digerire il vettore e legare gli inserti in 1 reazione: mantenere la reazione a 37 ° C per 2 h, a 50 ° C per 10 min, a 65 ° C per 15 min a 80 ° C per 15 min e infine , tenerlo a 4 ° C. Della nota, verificare che gli oligonucleotidi non contengono BsmBI siti prima di utilizzare questo metodo. Se il gRNAs che sono da clonare contengono siti di restrizione BsmBI, essi verrà digeriti dopo l’aggiunta di BsmBI. Ciò impedirà all’utente di ottenere qualsiasi trasformanti. Dopo la reazione iniziale semplice cancello, aggiungere un ulteriore 0,5 μL di enzima BsmBI ad ogni reazione e metterli torna a 55 ° C per 1 h. Dopo la digestione, mantenere la reazione a 4 ° C o congelarlo fino al momento di trasformare. Questo secondo turno di restrizione enzimatica incubazione rimuove qualsiasi non digerito o religated pSB700 di selvaggio-tipo vettoriale spina dorsale dalla miscela di reazione affinché soli vettori che hanno ricevuto gli inserti di oligo rimangono intatti e produrranno trasformanti. Procedere alla trasformazione (passo 9). Trasformare 0,5 μL di miscela di reazione in 8 μL di competente Escherichia coli [ad es., NEB DH5a (1-3 x 109 cfu / µ g di DNA di pUC19) o NEB stabile 1 – 3 x 109 cfu / µ g di DNA di pUC19). Per plasmidi lentivirali, cellule stabili NEB fornirà più coerente plasmide rendimenti. Rimuovere e. coli da conservazione a-80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min. Aggiungere 0,5 μL di miscela di reazione 8 μL di competente e. coli e mantenere la miscela sul ghiaccio per 30 min. La miscela a 42 ° C per 45 di scossa di calore s. Appoggiarla sul ghiaccio per 2 min. Recuperare la cultura su un agitatore rotante in 250 μL di media SOC per 1h a 37 ° C per NEB DH5a e a 30 ° C per stalle NEB. Piastra 80 μL della cultura su un’appropriata resistenza antibiotica piastra Lisogenesi brodo (LB) e incubare per una notte a 37 ° C per NEB DH5a e a 30 ° C per NEB scuderie [ad esempio, pSB700 è placcato su LB con piastre di ampicillina (100 μg/mL)] (Figura 3). Convalidare la sequenza del plasmide di espressione gRNA: verificare la sequenza di ogni colonia di Sanger sequenziamento utilizzando il primer 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′ quali numeri primi al promotore U6 a Monte di oligo il gRNA inserire. Prendere 2-3 colonie per reazione di sequenziamento (tabella 4).Nota: Diversi provider di sequenziamento ora offrire servizi che può eseguire Sanger sequenziamento direttamente dalle colonie batteriche, che riduce notevolmente i tempi e i costi, eliminando la necessità di purificare i plasmidi prima del sequenziamento. In alternativa, un kit di isolamento del plasmide può essere utilizzato per recuperare il DNA del plasmide da singoli cloni batterici. Plasmidi purificati quindi possono essere presentate per il sequenziamento. Se avviene una reazione di legatura in pool, è possibile utilizzare tabella 4 come guida per il numero di colonie che devono essere scelti e presentati per la sequenza. Dopo la conferma di sequenza, isolare i plasmidi di espressione gRNA. Utilizzare una pipetta sterile per inoculare la Colonia desiderata in una cultura di 5 mL di mezzo LB contenente 100 μg/mL di ampicillina per vettori di espressione pSB700. Crescere le cellule in un incubatore rotativo a 100 giri/min a 37 ° C durante la notte (30 ° C se vengono utilizzate NEB stalle). Isolare il DNA del plasmide dalle culture utilizzando un kit di preparazione del plasmide, seguendo il protocollo del produttore.Nota: Mentre i metodi di cui sopra consentono agli utenti di creare singoli vettori contenenti gRNA, questo protocollo consentirà agli utenti di creare vettori contenenti 2 gRNAs, ciascuno azionato dal proprio promotore di RNA polimerasi III. Per un design di gRNA accoppiati, utilizzare il file di output dagli strumenti di progettazione di sgRNA cui sopra (punti 1.1-1.4) e selezionare 2 guide di interesse. Per un’attivazione o repressione, selezionare le coppie di guide che sono almeno 30 nt a pezzi. Per gRNAs usato per il taglio, selezionate guide destinate a 2 diversi esoni del gene. Per le istruzioni qui sotto, designare il primo gRNA nella matrice gRNA-A e la seconda gRNA nella matrice gRNA-B, per creare una modifica di sequenza del oligonucleotide gRNA accoppiati.Nota: L’oligo utilizzato per creare gRNA-A si chiamerà fA, e l’oligo inverso utilizzato per introdurre gRNA-B deve essere indicato come rB. Il metodo di clonazione sotto aggiunge automaticamente un avvio G all’estremità 5′ di ciascuno della gRNAs. Creare l’oligo fA appropriato come segue.Nota: I 20 nucleotidi che comprende il gRNA targeting sequenza per gRNA-A volontà costituiscono la sequenza iniziale fA su cui i passaggi seguenti costruirà (ad es., protospacer – aggggctacaccactcattg). Aggiungere TTTTCGTCTCTCACCG all’estremità 5′ del cespite (ad es., della sequenza TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg). Aggiungere GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA all’estremità 3′ del cespite (ad es., della sequenza TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Questa è la versione finale dell’oligo fA che sarà ordinato. Creare il necessario oligo rB come segue.Nota: I 20 nucleotidi che comprende la sequenza targeting gRNA per gRNA-B costituirà la sequenza iniziale di rB su cui i passaggi seguenti costruirà (ad es., della gtcccctccaccccacagtg di sequenza iniziale). Prendere il complemento inverso di rB = (revcom) rB (ad esempio, cactgtggggtggaggggac). Aggiungere TTTTCGTCTCTAAAC all’estremità 5′ del (revcom) rB (ad es., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac). Aggiungere CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG all’estremità 3′ del (revcom) rB (ad es., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Questa è la versione finale dell’oligo di rB che sarà ordinato.Nota: le seguenti formule possono essere utilizzate con software di foglio di calcolo comune per modificare automaticamente le sequenze di oligo: = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2), “GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA”), dove A2 è la cella contenente la sequenza di fA e = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2),”CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG”), dove B2 è la cella contenente la sequenza di rB (revcom). Ordinare gli oligonucleotidi da un fornitore di sintesi di scelta. Non aggiuntive sono necessarie modifiche. Utilizzare il DNA del plasmide preparato per eseguire PCR con primer sia fA e rB. Questo verrà collegato entrambi avanti e la gRNAs inversa al frammento di PCR generati da questo plasmide e volontà consentire a ciascuno di essere espresso da un promotore (U6 e 7SK promotori — differenti promotori sono utilizzati in questo disegno per prevenire ricombinazione virale). Utilizzare il protocollo di PCR Phusion speciale GC per creare il frammento necessario: mantenere la miscela a 98 ° C per 1 min (1 ciclo), a 98 ° C per 15 s, a 53 ° C per 15 s, a 65 ° C per 2 min e a 72 ° C per 4 min (30 cicli) e poi tenerlo a 4 ° C (tabella 5). Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio all’1% e verificare quello 1 banda viene visualizzato a ~ 490 bp (Figura 2). Tagliare ed estrarre questo prodotto PCR utilizzando un kit di estrazione del gel di scelta. Eluire il DNA in 15 μL di tampone di TE (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) o acqua distillata. Misurare la concentrazione del prodotto estratto insieme a quella del vettore pSB700 con uno spettrofotometro per il calcolo di molarità di DNA. Normalizzare sia il prodotto PCR che il vettore a una concentrazione di 40 femtomoles/μL.Nota: Diversi siti Web sono disponibili per assistere con il calcolo della molarità di una specifica soluzione di DNA basata sulla lunghezza del DNA e la sua concentrazione in soluzione (ad esempio, di Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Il calcolatore utilizza la formula:Qui, N è la lunghezza della sequenza del nucleotide. Impostare una reazione di digestione e legatura simultanea restrizione utilizzando il protocollo descritto nei passaggi 8-8.4 per clonare il frammento della PCR in un vettore di pSB700. Invece di aggiungere 1 μL di soluzione di primer alla reazione, aggiungere 1 μL di 40 femtomole/μL del prodotto della PCR. Inoltre, è possibile utilizzare 1 μL del vettore pSB700 ad una concentrazione di 40 femtomole/μL.Nota: Rapporti molari uguali conducono ai risultati coerenti, sebbene anche nei casi in cui non vengono utilizzati i rapporti esatti, colonie possono essere ottenuti. Dopo aver completato il processo di reazione del Golden Gate (passaggi 8-8,4), procedere alla verifica di sequenza e trasformazione (passaggi 9 – 10.2.3).