CRISPR gids RNA klonen voor zoogdieren systemen

Opmerking: Het volgende protocol schetst het uitvoeren van gRNA design met behulp van online hulpmiddelen (stappen 1.1-1.4), die voor alle methoden van gRNA plasmide bouw gedetailleerde in dit manuscript gelden. Zodra de gewenste gRNAs worden geïdentificeerd, worden stappen voor het bestellen van de nodige oligonucleotides beschreven samen met verschillende methoden voor de invoering van de oligonucleotides in expressievectoren (bijvoorbeeld, pSB700). Gepresenteerd zijn 2 methodes voor het klonen van één gids-uiten vectoren gebaseerd op beide afbinding in een vereenvoudigd expressie vector (stappen 2-7.3) of Golden Gate klonen (stappen 8-8.4). Verder geschetst is een strategie voor klonen gepaarde gids-uiten vectoren met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR) gevolgd door Golden Gate klonen (stappen 11-16). Veelgebruikte methoden voor het uitvoeren van een chemische transformatie van E. coli (stappen 9-9.6) en een expressie vector reeks validatie (in stappen van 10 naar 10.2.3) zijn ten slotte ook beschreven. Ontwerp gRNA oligonucleotides met behulp van online tools als volgt. Ontwerp gRNAs met behulp van online hulpmiddelen zoals de sgRNA Scorer 2.0 online hulpmiddel (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 of alternatieven zoals de brede sgRNA design tool (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-ontwerp)14 en verscheidene anderen15. Gebruik de gene naam, symbool of ruwe doel opeenvolgingen van DNA te genereren van potentiële gRNA sequenties.Opmerking: Een werkbladbestand (.csv/.xls) met alle mogelijke gRNAs tegen de gen of de verstrekte sequentie wordt gemaakt. De kwaliteit van de potentiële gRNAs zal worden gerapporteerd als Score als de online tool sgRNA Scorer 2.0 wordt gebruikt, of als op-procent efficiëntie als de brede sgRNA design tool wordt gebruikt. Beide maatregelen worden afgeleid op op basis van de activiteit op de doelsoort snijden. Overwegen de Off-target activiteit in de gRNA selectie bij ranking van de gRNAs.Opmerking: Optimale gidsen zijn degenen met de grootste op de doelsoort efficiency en de minst off-target activiteit. Voor activering (CRISPRa), zijn gRNAs ontworpen om te richten op de regio van 1-200 bp stroomopwaarts van de transcriptionele start site (TSS)4,15. Voor remming (CRISPRi), gRNAs zijn ontworpen om te richten op de regio van 50 bp stroomopwaarts van de TSS tot 300 bp stroomafwaarts van de TSS5. Als u wilt uitschakelen een gen met behulp van de Cas9 snijden, zijn gRNAs ontworpen om het richten van de eerste 10-50% van de codering volgorde stroomafwaarts van de initiatiefnemende codon (als gRNAs gericht op de 3′-eind van het gen is gebleken dat minder effectief)13. Zorgen geen interne BsmBI sites zijn aanwezig als oligonucleotides worden gebruikt voor het Golden Gate klonen, aangezien dit in het ontharde oligonucleotides resulteren zal13wordt verteerd. De genomische doel-sequenties te selecteren en verwijderen de 3′ NGG PAM (verlaten alleen de volgorde van de protospacer) voor de enkele gRNA oligonucleotide reeks wijziging (bijvoorbeeldbeginnend volgorde: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).Opmerking: Als een werkblad gebruikt, is de volgende formule verwijdert 3′ NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), waar de A2 de cel is met de volgorde van de doelgroep en de PAM. CACCG aan het einde 5′ van de oligo toevoegen.Opmerking: Op afbinding met de pSB700-backbone, deze reeks bestaat uit de 3′-eind van de promotor van de U6 rijden de transcriptie van de gRNA. De volgorde van de “CACC” zorgt ervoor dat de oligo verenigbaar met het overhangen van de BsmBI-verteerd pSB700 vector is. De “G” is een eis van Polymerase III initiatiefnemers en zorgt voor de efficiënte inleiding van de transcriptie van de gRNA. Gebruik de volgende formule in een werkblad voor het uitvoeren van deze taak: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2)), waar B2 de cel is met de protospacer reeks [bijvoorbeeldhet toevoegen van de 5′ CACCG volgorde aan de protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (dit is de laatste voorwaartse oligo die is besteld)]. Maak een omgekeerde aanvulling (rc) van de protospacer-reeks.Opmerking: het omgekeerde complement van de bovengenoemde protospacer is bijvoorbeeld TGGATGAGGGAGAGCACGCG. Voeg AAAC aan het einde 5′ van de rc protospacer. Voeg een extra C aan het einde 3′ van de rc protospacer (omgekeerde oligo).Opmerking: De volgorde van de “AAAC” zorgt ervoor dat de oligo compatibel voor het klonen in de BsmBI-verteerd pSB700 vector. De extra “C” aan de 3′-kant is nodig om de volgorde aan de initiatiefnemende “G” toegevoegd aan de voorwaartse oligo anneal. Gebruik de volgende formule in een werkblad voor het uitvoeren van deze taak =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), waar de C2 is de cel met de omgekeerde aanvulling volgorde [bv, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (dit is de laatste omgekeerde oligo thats besteld)]. Bestel de oligonucleotides, zonder aanvullende wijzigingen op de oligonucleotides. De volgorde van de minimale hoeveelheid oligo vereist, zoals slechts zeer kleine hoeveelheden nodig zijn om de klonen reacties. Verdun gelyofiliseerd inleidingen om een eindconcentratie van 100 μM in 1 x TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 met 1 mM EDTA). Aliquot 1:1 voorwaartse en omgekeerde oligonucleotides (bijv, 10 μL elke) in PCR strip-cap buizen.Opmerking: Hierdoor kan de snelle klonen van veel gRNAs in een tijd met behulp van een meerkanaalspipet. Vortex en spin down de oligo mengsels (100 x g voor 15 s). Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten vóór de oprichting van de afbinding.Opmerking: Het is niet nodig om te verwarmen en vervolgens koelen de oligo mengsels om hun gloeien. Het is vermeldenswaard dat 3-4 paren van gRNA oligonucleotides kunnen worden gebundeld en gegloeid in een enkele reactie (b.v., mix 3 μL van vooruit en 3 μL van omgekeerde oligonucleotides samen van maximaal 4 gRNA oligo paren, geven een totaal volume van 24 μL). Het volume van de oligonucleotides gebruikt voor het gloeien kan worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van een gebruiker.Opmerking: De stappen 6-7.3 beschrijven de predigestion van pSB700. Voor een alternatieve methode, zie stap 8, waarin een-voor-stapmodus afbinding voor de beperking van de BsmBI. Het verteren van 1-5 μg van de geselecteerde pSB700 gids expressie vector met BsmBI (0,5 μL per 1 μg) gedurende 1 uur bij 55 ° C15. Het gedrag van de vertering van de pSB700 gRNA expressie vector in een totaal volume van 40 μL (tabel 1). De spijsvertering-producten worden uitgevoerd op 1,5% (wt/vol) laag-smelten agarose gel. Knip de verteerd vector ruggengraat band die correspondeert met een fragment van ~ 9 kb in grootte en plaats van het gel-segment in een tube microcentrifuge 1,5 mL (Figuur 1). Gebruik een commerciële gel zuivering kit te uittreksel van het DNA van het agarose gel volgens de instructies van de fabrikant. Elueer de DNA in 10-15 μL van TE buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM Tris, pH 8,0) te verkrijgen van een geconcentreerde eluaat. Het afbinden van de ontharde gRNA oligonucleotides uit stap 4 in de pSB700 BsmBI-verteerd gids expressie vector in een 20 μL reactie (tabel 2) voor het klonen van de gRNA oligonucleotides in de vooraf verteerd pSB700 expressie vector. Ten eerste, toevoegen van water, buffer, en DNA, dan vortex het mengsel en Voeg enzym, vortex 1 laatste keer na toevoeging van het enzym en spin down de oplossing (100 x g voor 15 s). Incubeer de reacties bij kamertemperatuur ‘s nachts. Omvatten de reactie van een neen-invoegen negatieve controle die een BsmBI-verteerd vector alleen, zonder een ontharde gRNA oligo invoegen heeft. 1 μL van water kan worden gebruikt in plaats van de 1 μL van gRNA oligonucleotides voor de negatieve controle van neen-invoegen. Ga naar de transformatie (stap 9).Opmerking: Stap 8 is een alternatieve methode om de predigestion van pSB700 zoals beschreven in stappen 6-7.3. GRNA oligonucleotides (beschreven in stappen 1-5.1) in de vector pSB700 door het gebruik van de Golden Gate klonen voor de-voor-stapmodus BsmBI beperking afbinding introduceren. Monteren van de master mix (1 x) — als meerdere gRNAs zijn worden gekloond, bereiden de master mix zonder de invoegen oligonucleotides toegevoegd (tabel 3). Aliquot de meester Meng in PCR buizen en een meerkanaalspipet met de gRNA oligonucleotides vanaf stap 4.2 toevoegen. Een besturingselement van de neen-invoegen met behulp van 1 μL van water opnemen. Door het BsmBI enzym en T4 DNA ligase binnen dezelfde reactie, gelijktijdige beperkingsspijsvertering en Afbinding worden bereikt (d.w.z., Golden Gate klonen). De volgende eenvoudige Gate-protocol gebruiken om te verteren de vector en het afbinden van de inserts in 1 reactie: houden van de reactie bij 37 ° C gedurende 2 uur, bij 50 ° C gedurende 10 minuten, bij 65 ° C gedurende 15 minuten, bij 80 ° C gedurende 15 minuten, en ten slotte , houd het bij 4 ° C. Van de nota, controleert u of de oligonucleotides bevatten geen BsmBI sites voordat u deze methode gebruikt. Als de gRNAs die zijn wordt gekloond BsmBI beperkingsplaatsen bevatten, zal ze op de toevoeging van BsmBI worden verteerd. Dit zal verhinderen dat de gebruiker transformants verkrijgen. Na de eerste reactie van de eenvoudige poort, een aanvullende 0,5 μL van BsmBI enzym aan elke reactie toevoegen en plaats ze terug bij 55 ° C gedurende 1 uur. Na de vertering, houd van de reactie bij 4 ° C of bevriezen tot klaar om te transformeren. Deze tweede ronde van restrictie-enzym incubatie verwijdert onverteerd of religated wild-type pSB700 vector ruggengraat uit het reactiemengsel zodat alleen vectoren die hebben ontvangen de oligo-inserts intact blijven en transformants zal opleveren. Ga naar de transformatie (stap 9). 0,5 μL van het reactiemengsel omvormen 8 μL van bevoegde E. coli [bijvoorbeeldNEB DH5a (1-3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA) of NEB stabiele 1 – 3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA). Voor lentivirale plasmiden geven stabiele NEB cellen meer consistente rendementen van de plasmide. E. coli verwijderen uit opslag bij-80 ° C en het ontdooien op ijs voor 5-10 min. Voeg toe 0,5 μL van de reactie mix aan 8 μL van bevoegde E. coli en houd het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten. Warmte schok het mengsel bij 42 ° C gedurende 45 s. Houd het ijs gedurende 2 minuten. Herstellen van de cultuur op een rondschudapparaat in 250 μL van SOC media gedurende 1 uur bij 37 ° C gedurende NEB DH5a en bij 30 ° C gedurende NEB stallen. Plaat 80 μL van de cultuur op een passende antibiotica-resistentie lysogenie Bouillon (LB) plaat en het na een nacht bebroeden bij 37 ° C gedurende NEB DH5a en bij 30 ° C gedurende NEB stallen [bijvoorbeeldpSB700 is verzinkt op de LB met ampicilline (100 μg/mL) platen] (Figuur 3). De volgorde van gRNA expressie plasmide valideren: Controleer of de volgorde van elke kolonie door Sanger sequencing met behulp van de primer 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3′ welke priemgetallen op de U6 promotor stroomopwaarts van de gRNA-oligo invoegen. Kies 2-3 kolonies per reactie voor sequencing (tabel 4).Opmerking: Diverse sequencing providers nu aanbod die diensten kunnen uitvoeren Sanger sequencing rechtstreeks vanuit bacteriële kolonies, die sterk vermindert de tijd en kosten door het elimineren van de noodzaak om te zuiveren van de plasmiden voorafgaand aan het rangschikken. Een plasmide isolatie kit kan ook, worden gebruikt om te herstellen van de plasmide-DNA van de individuele bacteriële klonen. Gezuiverde plasmiden kunnen vervolgens worden voorgelegd voor het rangschikken. Als de reactie van een gegroepeerde Afbinding wordt uitgevoerd, gebruikt u tabel 4 als een gids voor het aantal kolonies die moeten worden geselecteerd en ingediend voor het rangschikken. Na de bevestiging van de reeks, de gRNA expressie plasmiden te isoleren. Gebruik een steriele Pipetteer tip om te enten van de gewenste kolonie in een cultuur van 5 mL van LB medium waarin 100 μg/mL ampicilline voor pSB700 expressievectoren. Het groeien van cellen in een roterende incubator op 100 rpm bij 37 ° C’s nachts (30 ° C als NEB stallen worden gebruikt). Isoleren van de plasmide DNA uit de culturen die met behulp van een plasmide prep kit, volgens protocol van de fabrikant.Opmerking: Hoewel de bovenstaande methoden gebruikers maken één gRNA-bevattende vectoren laten, dit protocol kunnen gebruikers maken van vectoren die 2 gRNAs, elk aangedreven door hun eigen RNA polymerase III promotor bevatten. Voor een gekoppelde gRNA-design, gebruik van de output file van de sgRNA-ontwerpgereedschappen bovengenoemde (stappen 1.1-1.4) en selecteer 2 gidsen van belang. Selecteer voor een activering of onderdrukking, paren van gidsen die ten minste 30 nt uit elkaar. Voor gRNAs gebruikt voor het snijden, selecteert u hulplijnen die gericht zijn op 2 verschillende exons binnen het gen. De onderstaande instructies, wijst de eerste gRNA in de matrix gRNA-A en de tweede gRNA in de matrix gRNA-B, bij het maken van een gekoppelde gRNA oligonucleotide reeks wijziging.Opmerking: De oligo gebruikt voor het maken van gRNA-A zal worden genoemd fA, en het omgekeerde oligo gebruikt om de gRNA-B zal worden verwezen als rB. De klonen methode hieronder voegt automatisch een initiërende G aan het eind 5′ van elk van de gRNAs. Maak de juiste VA-oligo als volgt.Opmerking: De 20 nucleotiden, bestaande uit de gRNA dat targeting op volgorde voor gRNA-A zal vormen de volgorde van de eerste VA-waarop de volgende stappen (bijvoorbeeldprotospacer – aggggctacaccactcattg) zal bouwen. Voeg TTTTCGTCTCTCACCG aan het einde 5′ voor fA (bijvoorbeeldvan de reeks TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg). Voeg GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA aan het einde 3′ voor fA (bijvoorbeeldvan de reeks TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Dit is de definitieve versie van de VA-oligo, die zal worden besteld. Maak de nodige rB oligo als volgt.Opmerking: De 20 nucleotiden, bestaande uit de gRNA gericht op volgorde voor de gRNA-B zal de eerste rB volgorde waarop de volgende stappen (bijvoorbeeldvoor de startende volgorde gtcccctccaccccacagtg) zal bouwen. Neem het omgekeerde complement van rB (revcom) = rB (bijvoorbeeld, cactgtggggtggaggggac). Toevoegen van TTTTCGTCTCTAAAC aan het einde 5′ van (revcom) rB (bv., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac). Toevoegen van CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG aan de 3’-eind van (revcom) rB (bvTTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Dit is de definitieve versie van de rB oligo, die zal worden besteld.Opmerking: de volgende formules kunnen worden gebruikt met algemene spreadsheetsoftware automatisch bewerken de oligo-reeksen: = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTCACCG”,(A2), “GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA”), waar de cel met de VA-reeks en inhoud is van A2 = CONCATENATE(“TTTTCGTCTCTAAAC”,(B2),”CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG”), waar B2 is de cel met de volgorde van de rB (revcom). De oligonucleotides bestellen bij een leverancier van de synthese van keuze. Er zijn geen extra wijzigingen vereist. Gebruik het bereid plasmide DNA PCR uitvoeren met zowel fA en rB inleidingen. Dit zal zowel de voorwaartse hechten en de omgekeerde gRNAs aan het PCR fragment gegenereerd op basis van deze plasmide en zal toestaan dat elk van zijn eigen promotor worden uitgedrukt (U6 en 7SK initiatiefnemers — verschillende initiatiefnemers worden gebruikt in dit ontwerp om te voorkomen dat virale recombinatie). Phusion GC speciale PCR Protocol gebruiken om de benodigde fragment maakt: Houd het mengsel bij 98 ° C gedurende 1 minuut (1 cyclus), bij 98 ° C gedurende 15 s, bij 53 ° C gedurende 15 s, bij 65 ° C gedurende 2 minuten, en bij 72 ° C gedurende 4 minuten (30 cycli) , en houdt het bij 4 ° C (tabel 5). Uitvoeren van het PCR-product op een 1% agarose gel en controleer of die 1 band is te zien op ~ 490 bp (Figuur 2). Knippen en haal deze PCR-product met behulp van een gel extractie kit van keuze. Elueer de DNA in 15 μL van TE buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM Tris, pH 8,0) of gedestilleerd water. De concentratie van het uitgepakte product samen met dat van de vector pSB700 meten met een spectrofotometer voor de berekening van de molarity DNA. Normaliseren van het PCR-product zowel de vector tot een concentratie van 40 femtomoles/μL.Opmerking: Meerdere websites zijn beschikbaar om te helpen bij de berekening van de molarity van een bepaald DNA-oplossing op basis van de lengte van het DNA en de concentratie in de oplossing (bijvPromega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). De rekenmachine gebruikt de formule:N is hier, de lengte van de nucleotide sequentie. Een gelijktijdige beperking spijsvertering en Afbinding reactie via het protocol beschreven in stappen 8-8.4 aan kloon van het PCR fragment in de vector van een pSB700 instellen. In plaats van 1 μL van primer oplossing aan de reactie toe te voegen, voeg 1 μL van 40 fmole/μl van het PCR-product. Daarnaast gebruiken 1 μL van de vector pSB700 bij een concentratie van 40 fmole/μL.Opmerking: Gelijke molaire verhoudingen tot consistente resultaten leiden, hoewel zelfs in gevallen waarin exacte verhoudingen niet worden gebruikt, kunnen de kolonies worden verkregen. Na het voltooien van de Golden Gate reactie proces (stappen 8-8.4), gaat u verder met de transformatie en volgorde verificatie (stap 9 – 10.2.3).