מידול שארקו-מארי-טות במבחנה על-ידי Transfecting Motoneurons ראשי העכבר
Summary
מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.
Abstract
הייתה שם הקשורים ניוון מוחיים של עמוד השדרה motoneurons (MNs) במגוון גדול של הפרעות נוירולוגיות כולל נוירודגנרטיביות שארקו-מארי-טות ‘, ניוון שרירי עמוד השדרה, אשר ישויכו כולן ניוון שרירים. תרבויות העיקרי MNs בעמוד השדרה היו בשימוש נרחב כדי להדגים את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות כגון ולאפיין את ההשלכות שלהם מוטציות הסלולר. תרבות זו מודלים MN העיקרי פרוטוקול נגזר העבודה החלוצי של הנדרסון ועמיתיו לפני יותר מעשרים שנה. ראשית, אנחנו פירוט שיטת לנתח את הקרניים הקדמי של חוט השדרה של העובר העכבר ובידוד MNs מגבולות תאים באמצעות מעבר הדרגתי צפיפות. לאחר מכן, אנו מציגים דרך חדשה ביעילות transfecting MNs עם פלסמידים ביטוי באמצעות magnetofection. בסופו של דבר, אנחנו להמחיש כיצד לתקן, immunostain העיקרי ש-mns. באמצעות neurofilament מוטציות הגורמות שארקו-מארי-שן מחלות מסוג 2, פרוטוקול זה מדגים בגישה איכותית המבטאים חלבונים עניין ולימוד שלהם מעורבות MN, תחזוקה, וצמיחה של הישרדות.
Introduction
מחלות נוירומוסקולריות מקיפים מגוון רחב של פתולוגיות ברורים קליניות, גנטית המאופיינת על ידי משינוי של שריר ו/או מערכת העצבים. הודות להתפתחות הטכנולוגית של טכנולוגיות רצף, מאות גנים אחראים אלה מחלות נדירות זוהו במהלך העשור האחרון (הרשימה זמינה במרכז המחלה Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). מגוון מוטציות מזוהה מציין כי מוטציות שונות בגן גן יחיד יכול לגרום מתבטא בצורות שונות ומחלות1,2,3 , כי מוטציות בגנים שונים ניתן לייצר דומה פנוטיפים 4 , 5. בהקשר זה, ישנם מאמצים לפתח דגמי הסלולר שיכולים להיות כלים רבי-עוצמה לניתוח ההשלכות מוטציה ומנגנונים פתולוגי.
MNs בעמוד השדרה יש somas גדולה הממוקמת הקרניים הבטני של חוט השדרה, אקסונים ארוכים טופס היעד סיבי שריר השלד, ולאפשר תנועות מרצון באמצעות השחרור אצטילכולין ובצמתים עצב-שריר. מאז MNs מושפעות על ידי מחלות נוירומוסקולריות כגון נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות (CMT), ניוון שרירי עמוד השדרה, דוקטור הנדרסון ועמיתיו פיתחו הראשון פרוטוקול6 שמותר קומפלקסים במבחנה MNs בעמוד השדרה, על גילוי neurotrophic גורם GDNF7 (תא גליה נגזר neurotrophic פקטור). ליטושים טכני מאז אפשרו לטיהור מדויקת יותר של עמוד השדרה MNs ובסוגי שלהם באמצעות FACS8, אך העשרה על ידי צפיפות הצבע נשאר בשימוש נרחב ועוצמתי במעבדות כרגע עובד עם MNs בעמוד השדרה הראשית 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. לאחר מכן, זה גם אפשרי להשיג ציון גבוה יותר של טיהור MN דרך immunopanning על ידי ניצול של סמן משטח p75(NTR)15,16,17.
חוט השדרה מכיל תתי סוגים שונים של צוואר הרחם,, מותניים MNs, וכן החציוני לרוחב המנוע וטורים שונים בין המיקום שלהם ב הצופר הקדמי על ציר dorso-הגחוני /, בין היעדים הם innervate8, 18. תרבויות MN הראשי יכול לשחזר את כל תת אלה MN בפרופורציות פיזיולוגיים. המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא המספר הנמוך של MNs שהושג בסופו של ההליך; למעשה, ניתן לצפות להשיג סביב 105 MNs של שישה עוברי, אשר מתאימה מיקרוסקופ, אבל הגבלת לניסויים ביוכימיה. ביצוע ניסויים עם יותר סטנדרטית יחוברו, שופע MNs (> 106 תאים) עובריים תאי גזע-derived MNs צריך להיחשב18.
תרביות תאים של transgenes פראי-סוג/מוטציה או תמונות ציפורים גנים אנדוגני לתוך MNs העיקרי הוא כלי מהיר ויעיל עבור פענוח מסלולים physiopathological, במיוחד כאשר העכבר מודלים אינן זמינות. Magnetofection היא טכניקה אחת עבור נוירונים העיקרי transfecting, הדומה lipofection בלי neurotoxicity קשורים. יתר על כן, ניתן לבצע תרביות תאים בנוירונים בוגרים לאחר מספר ימים במבחנה, בניגוד טכניקות בהתבסס על אלקטרופורציה9. אולם חיסרון אחד של שיטה זו הוא כי החרוזים לאגד חומצות גרעין בתרבות, גרימת רעש דאפי תיוג. זיהום ויראלי הוא כנראה הטכניקה היעילה ביותר עבור transfecting MNs; עם זאת, magnetofection אינו מצריך מסוימים נהלי הבטיחות לצורך ייצור ויראלי ולדלקת הסלולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד של נקודות קריטיות של פרוטוקול זה הוא העוברים העכבר הם שפרופסור-חלון זמן מדויק במהלך הפיתוח (E12.5) כדי למטב את כמות MNs שהושג בסופו של דבר. בנוסף, עבור תשואה אופטימלית, הקרע צריכה להתבצע בבוקר או בשעות אחר הצהריים המוקדמות. לפני E12.5 (למשל, ב- E11.5), ניתוח קשה, במיוחד לגבי חיסול של קרומי המוח….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות את “האגודה יציקת le développement de la neurogénétique” אחוות של ד ר Jacquier, AFM-הטלויזיונית על התמיכה באמצעות תוכנית אסטרטגית MyoNeurAlp. אנחנו רוצים גם תודה ד ר כריס הנדרסון, ד ר ויליאם camu ב, ד ר בריג’יט Pettmann, ד ר סדריק ראול ו ד ר גיאורג Haase, אשר השתתף בפיתוח ושיפור הטכניקה ולהפיץ את הידע שלהם.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
