Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

여기에 설명 된 모든 실험 영국 동물 (과학적인 절차) 행위 1986 년에 포함 된 지침에 따라 수행 했다 그리고 여왕의 벨파스트의 대학 동물 복지와 윤리적 검토 기관에 의해 승인 했다. 1입니다. 망막 Arterioles의 격리 참고: 다음 프로토콜 망막 arterioles 격리 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 쥐 망막 arterioles 최적화 하지만 마우스 망막에와 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 마우스를 사용 하는 경우, 혈관의 수익률은, 낮은입니다. 낮은 Ca2 + 표 1에서 같이 행 크 스 (LCH)를 포함 하는 솔루션을 확인 합니다.참고:이 솔루션은 4 ° C에서 최대 3 일 동안 저장 될 수 있다 (LCH 저장 사용 하 여, 확인 그것은 실내 온도에 equilibrates와 pH는 사용 하기 전에 올바른). 이전에 망막의 급속 한 서를 보장 하기 위해 조직의 컬렉션 다음 장비 조립: 집게 (무딘) 1 유리의 2 세트, 해 부 접시 (Petri 접시 실리콘 코팅), 단일 깨끗 블레이드, 곡선된가 위, 집게 톱니 파스퇴르 피 펫 (불 부드러운 하지만 하지 좁은 팁에 광택), 1 회용 플라스틱 피 펫 (조리개를 증가 손질 하는 팁 ~ 5-7 m m), 1 유리 라운드 하단 테스트 튜브 (5 mL)과 홀더. 약 50 mL LCH 유리 비 커에 가만히 따르다 하 고 폐기물 체액을 가만히 따르다을 두 번째 비 커를 준비.주: 사양 및 제조 업체 정보에 대 한 재료의 표를 참조 하십시오. CO2 심장 찔린 다음 exsanguinate를 사용 하는 쥐를 안락사 (피하기 자 궁 경관 탈 구 또는 뇌 진 탕이 눈에 있는 혈관을 손상 될 수 있습니다). 톱니 모양의 포 셉으로 눈 꺼 풀을 철회 다음 곡선된가 위를 사용 하 여 시 신경에 통해 궤도 근육 주위를 잘라. 부드럽게가 위 나머지 첨부 파일을 극복 하도록 궤도에서 눈을 추출 합니다. 눈 LCH 솔루션 (눈 수송 될 수 있다 얼음 LCH의 솔루션에서에 필요한 경우) 해 부 접시에에 놓습니다. 무뚝뚝한 겸 자에의 한 세트를 사용 하 여 궤도 근육 첨부 파일 또는 시 신경;을 개최 하 여 접시에 눈을 고정 앵커 포인트 눈 안정 sclera에 가능한 한 가까이 있는지 확인 합니다. 블레이드를 사용 하 여, ora 참나무 따라 각 막 극복 하 고 집게와는 sclera에 부드럽게 눌러 렌즈를 제거 합니다. 반 대칭 광학 디스크 통해 눈 컵을 잘라. 사용 하 여 폐쇄 집게 부드럽게 ‘브러시’ 광학 디스크에 남아 있는 첨부 파일을 제거 하도록 하는 아이피의 두 반쪽에서 망막에 밖으로. 두 번째 눈으로 과정을 반복 하 고 해 부 망막 LCH 매체의 플라스틱 피 펫 및 작은 하락을 사용 하 여 시험 관으로 전송. 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 작성에 LCH와 테스트 튜브 ~ 5 mL 망막 바닥에 침전 하 고. 씻어 조직 약 3 번을 제거 하 여 ~ 4 mL 튜브와 신선한 LCH 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 추가에서 솔루션의. 필요한 경우, 외부 조직 매 다 인 대, 유리 체, 머리카락 등을 제거 합니다. 유리 조직 피펫으로에 집착 하지 않도록 LCH와 파스퇴르 피 펫 (광택된 끝)의 내부를 세척. 동일한 피 펫을 사용 하는 시험 관에서 솔루션의 약 4 mL를 제거 합니다. 신선한 LCH의 약 2 개 mL를 추가 합니다. 부드럽게 해리 (triturate) 유리의 끝을 통해 조직의 여 망막 천천히 플라스틱 및 내용에는 시험 관 추방. 참고,이 단계에서 거품을 소개 하지 않으려고 합니다. 1.10 단계를 반복 하 여 약 2-3 m m2의 크기에는 망막 나누어진다. LCH의 약 2 mL를 피펫으로의 내부를 세척 하 고는 시험 관으로 이것을 추방. 내용을 아래 5-10 분 이상 정착을 허용 합니다. 조직 조각 때까지 약 1 m m2 크기에 좀 더 힘과 1.10-1.12에 설명 된 대로 분쇄 과정을 반복 합니다. 또, 5-10 분에 대 한 정착을 조직을 수 있습니다. 내용을 완전히 무 균 하 고 망막의 아무 조각 남아 때까지 반복 단계 1.10-1.12 제 3 더 많은 힘과 시간 (솔루션 외관에서 하얀 될 한다).참고:이 기술은 최대 8 arteriolare 세그먼트 (상대적으로 그대로 남아 있는 몇 가지와 주변 neuropile의 무료)를 얻을 것입니다 / 8-45 µ m 직경 및 200-2500 µ m 길이에서 측정 하는 격리. 생리 녹음 실에는 격리의 작은 수량을 전송 하거나 세포내 캘리포니아2 + 농도 ([캘리포니아2 +]i; 참조 섹션 3)의 측정을 위한 형광 염료를 추가 합니다. 눈 컵 및 동물 폐기물의 처리에 대 한 로컬 규칙에 따라 격리 프로세스 중에 제거 하는 솔루션의 나머지의 처분.참고: 지금까지 즉시 분리 후에 실험 하는 것이 좋습니다 동안에 잉여 격리 8 h까지 4 ° C에서 저장할 수 있습니다. 2. arteriolar 압력 Myography 참고: Arteriolar 압력 myography 장비 그림 1A, B 와 재료의 테이블에대 한 자세한를 사용 하 여 다음과 같이 수행 됩니다. 망막 배 homogenate의 약 수를 전송 (1-2 mL; 섹션 1에 의하여 고립) 생리 녹음 실로 (부분적으로 채워진 명목상 캘리포니아2 +무료 행 크 스의 솔루션; 0Ca2 + 행 크 스 ‘; 표 1참조)의 단계에는 거꾸로 현미경. 실험 전에 적어도 5 분 동안 녹음 챔버의 하단에 정착 하는 혈관을 남겨 주세요. 시각적으로 식별 arterioles > 200 µ m 길이에 선박을 cannulated 수 오픈 엔드를 소지 하 녹음 실에서 스캔 (선박 종류의 추가 탐구 결과 섹션에서). 보기의 필드의 위치는 센터에 있는 배입니다. 없는 적당 한 용기 있는 경우, 단계 2.1에 의하여 녹음 실로 선박 homogenate의 또 다른 약 수를 전송. 선박 미세 집게를 사용 하 여 작은 텅스텐 와이어 슬립의 한쪽 끝을 앵커 (75 µ m 직경 고 ~ 길이에 2-4 m m) 선박 배치 ( 그림 1C(i) 참조). 이 집게에는 와이어를 잡고 하 고 녹음 실 위에 집게를 찾습니다. 현미경 집게의 해당 그림자를 식별, 와이어 명백한 될 때까지 목욕에는 집게를 낮은. 오픈 엔드에서 선박 약 200 µ m 와이어를 놓고 하 고 혈관의 긴 축에 수직인 와이어를 놓습니다.참고: 텅스텐 와이어의 무게 distally cannulation 및 가압 중 luminal 내용의 흐름을 중지 하는 선박을 가리고 충분 하다. 가압 정 라인 오픈 엔드 욕조에 걸쳐 가로로 거짓말 같은 되는 녹음 챔버 내 적당 한 위치에 이동 ( 그림 1C(ii-4) 참조). 이렇게 부드럽게 와이어 집게; 내 추가 섹션 occluding 텅스텐 와이어 슬립을 이끌어 그것은 돌이킬 수 없는 집게를 준수 것으로 되를 만지지 마십시오. (오래 되 세그먼트)에 대 한 필요한 경우, 추가 추가 텅스텐 와이어 전표는 그릇 같은 혈관의 폐색과 열린 끝 사이의 거리는 더 이상 200 µ m; 이 가압 시 시야 이동 되를 방지할 수 있습니다. 배는 어떤 측면, 하는 경우이 또한 추가 텅스텐 와이어 전표로 차단 한다. 측면 지점 가려진 수 없습니다 경우 선박 폐기. 0Ca2 + 행 크 스 외부 망막 조직을 제거 하 고 따뜻한 목욕을 생리 적인 온도 37 ° C에서 챔버 perfuse참고: 표준 중력 먹이 목욕 관류 및 인라인 히터 시스템은이 목적을 위해 사용할 수 있습니다 ( 그림 1A참조). 외부 Ca2 + 보장의 제거 이후는 arterioles 유지 확대, 0Ca2 + 행 크 스 ‘ cannulation 절차를 촉진 하기 위하여 사용. Filamented 붕 규 산 유리 모 세관 (cannulated 될 그릇의 직경에 따라 팁 직경 3 ~ 10 µ m; 좁은 뉼 필요; 테이블의 자료를 보고 작은 혈관)에서 가압 뉼 조작 사용 하는 microelectrode 끌어당기는 고 0Ca2 + 행 크 스의 솔루션으로 다시 채우십시오. 정 맥의 칼 팁 cannulation 촉진을 향해 부드럽게 테이퍼는 확인 합니다. Y 커넥터 및 3-방향 탭;를 통해 10 mL 주사기에 부착 된 피 펫 홀더에 캐 뉼 러를 탑재 이것은 압력 시스템, 팔에 부착 된에 다른 측면-Y-커넥터의 압력 계를 사용 하 여 기록 되 고 압력을 사용 (참조 그림 1B).참고: ‘도우미’ 피 펫 cannulation 과정을 지원 하기 위해 필요 합니다. 0.5의 팁 직경 microelectrode 끌어당기는 사람에는 붕 규 산 유리 모 세관 피 펫 조작-2 µ m. 무 겁 게 불 폴란드어는 microforge를 사용 하 여 피 펫 (종종 닫힐 때까지). 신중 하 게 위치 도우미 피펫으로 혈관의 긴 축에 직각에 가까운 3 축 기계 조작자를 사용 하 여 오픈 엔드 ( 그림 1D참조). 바로 위에 선박, 하지만 그것에 감동 하지 도우미 피 펫을 놓습니다. 선박의 오픈 끝 cannulation 피펫으로 위치 ( 그림 1D 및 2A(i) 참조) 좋은 micromanipulator;를 사용 하 여 위치는 오프닝에 인접 한 팁 (20 X)에서 현미경에 초점의 비행기를 조정 하 여 평가. 때 그릇 끝 정 팁 모두 동시에 정 위치 올바르게 cannulation에 대 한에 초점에는 ( 그림 2A(ii) 참조). 가압 정 좋은 micromanipulator의 x 축 컨트롤을 사용 하 여 선박 조리개에 사전 ( 그림 2A(iii) 참조). Y 축 따라 정 이동 하 여 cannulation의 성공을 평가 합니다. 정 맥 혈관 내에서 유지 되는 경우 그것은 성공적으로 cannulated ( 그림 2A(4) 참조)입니다. 정 배; 위에 될 것입니다 경우에 정 맥 혈관의 이상으로 이동, 그렇다면 단계 2.10 2.11 z 축에는 더 낮은 단계에서 정 맥으로 반복 합니다. 성공적인 cannulation 시 부드럽게 억제 되는 선박에 도우미 피펫으로 낮은. Arteriolar 벽 안내 도우미 피펫으로와 가압 정에 동시에 cannulation 피펫으로 고급 추가 약 30-50 µ m의 거리에 선 루멘으로 ( 그림 2A(v, vi) 참조).참고:이 절차는 동시, 통제 운동의 두 조작자 (도우미 피 펫은 정 배 루멘으로 이동 하는 동안은 정 쪽으로 이동)을 필요로 높은 성공률을 달성 하기 위해 광범위 한 연습을 요구할 것 이다. 2mm 캘리포니아2 + 를 포함 하는 정상 행 크 스에 목욕 솔루션 변경 ( 표 1참조) 37 ° c.에 일반적으로이 되 고 가압 정 주위 단단한 물개를 형성의 약간의 축소로 인해. 도우미 피펫으로 다음 선박에서 이동할 수 있습니다. 15 분 보기 USB 카메라 (및 이미지 수집 소프트웨어)를 사용 하 여 배 현미경에 부착 하 고 선박 경계와 (참조 외부 intraluminal 공간을 최대화 하기 위해 초점을 조정에 대 한 개발을 단단한 물개를 허용 그림 2B). 0.5-에서 선박 이미지 5 프레임/s. 0 mmHg에서 녹음의 1 분 후 가압 정 맥에 연결 된 3-방향 탭을 닫아 원하는 수준 intraluminal 압력을 증가 ( 그림 1B참조) 주사기를 통해 시스템에 긍정적인 압력의 작은 금액을 적용. 압력은 압력 계에 변화를 관찰 합니다.참고: 압력 수에 추가 될 단계 현명한 패션 100 mmHg 또는 값 예 40 mmHg ( vivo에서망막 arteriolar 압력에 가깝게)23. 배 빠르게 성공적인 cannulation 확인 팽창 한다. 참고, 압력 유도 vasoconstriction (즉, 조직적 응답) 이후 15 분 동안 개발할 것입니다 하지만 이러한 혈관의 작은 크기 때문에이 되지 않을 수 있습니다 항상 시각적으로 감지. 신중 하 게 분명 한 누수에 대 한 초기 가압 중 선박을 모니터링 합니다. 누출의 소스는 되 안쪽 쪼개진된 쪽 지점 또는 정 맥의 부적 절 한 씰링에서 발생 수 있습니다. Intraluminal 내용을 떠나 선박에 대 한 감시. 더 작은, 보다 적게 명백한 누수는 압력 계에 압력에 있는 하락으로 시간이 지남에 명백한 될 수 있습니다. 만약에 가능 하다 면, 추가 텅스텐 와이어 전표는 정을 방해 하지 않도록 주의 복용으로 개방을 막다. 추가 분석에서 분명 한 누설 준비를 제외 합니다. 이전에 선박 또는 다음, (전 수 결정, 후자 수 효과의 분석 하는 동안 조직적 톤의 개발에 대 한 효과 실험의 목적에 따라 15 분 가압 관심 abluminally의 약 적용 에 정상 상태 조직적 톤). 전형적인 약물 전달 시스템은 그림 3A에서 그림입니다. 관심의 배 부분에 수직인 배달 콘센트 (같이 그림 1D) 거리에 위치 ~ 500 µ m 되도록 돌의 배 멀리 콘센트는 최적에 직각 완전히 superfuse 지역 (참조 그림 3B). 관류에 변경 할 물리적으로 선박을 방해 하지 확인 하십시오. 실험의 완료, 다음 적용 0Ca2 + 행 크 스 ‘의 솔루션 극대 같은데요 수동 직경을 결정 하는 선박을 포함 하는 10 µ M wortmannin (myosin 경 쇄 키 니 아 제 억제 물).참고: cannulation 인감의 강도 시험 될 수 있다 실험의 결론에서 intraluminal 압력을 발생 시켜 > 100 mmHg. 대부분의 혈관이 높은 압력 단단한 물개를 나타내는에 연결 된 유지 됩니다. 가장자리 감지를 사용 하 여 arteriolar 직경의 변경 내용을 추적 하는 오프 라인 분석 수행 (제안 된 소프트웨어에 대 한 재료의 표 참조). 혈관 사이의 비교에 대 한 수동 직경 되 직경 정상화. 3. 캘리포니아2 + 영상 참고: 격리 된 망막 arterioles 기존의 (microfluorimetry)에 대 한 준비가 그리고 confocal 캘리포니아2 + 로 이미징 다음과 같습니다 (장비 재료의 테이블에에서 대 한 자세한 사용). 섹션 1에서에서 설명한 대로 5 mL 유리 시험관에서 망막 homogenates를 준비 합니다. 망막 homogenate의 1 mL를 추가 오전 Fura-2 (microfluormetric 캘리포니아2 + 녹음) 또는 오전 Fluo-4 (confocal 캘리포니아2 + 영상) 5 µ M의 최종 농도 (빛에서 보호); 염료 지표 부드러운 근육 세포에 우선적으로 로드합니다. 2 h flicking 튜브의 측면에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 다시 망막 조직을 중단 모든 15-20 분을 유지 합니다. 그 후, 희석 LCH 솔루션을 로드 하는 염료를 더 줄이기 위해 함께 homogenate 1:4.참고: 배 유지 가능한 최대 6 h (4 ° C에서 어둠 속에서 저장) 하는 경우; 그러나 실험 내부 세포에 있는 염료의 구획 또는 시간이 지남에 따라 염료의 압출의 영향을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 개시는 것이 좋습니다. 캘리포니아2 + microfluorimetry 또는 confocal 현미경 시스템에 연결 된 거꾸로 한 현미경의 스테이지에는 유리 바닥 녹음 실로 (부분적으로 LCH 가득 함) 망막 homogenate의 1-2 mL를 전송 합니다. 녹음 실로, 텅스텐 와이어 전표 (50 µ m 직경, 길이 2-4 m m)와 간격에 걸쳐 arterioles 흐름의 방향에 수직인 앵커 ~ 100-200 µ m 선박 길이 따라 간격 ( 그림 3C참조) 설명 하는 비슷한 기술을 사용 하 여 2.3 단계. 37 ° c.에 정상적인 Ca2 + 행 크 스의 솔루션과 목욕 perfuse 그림 3C 에서 그림으로 마약 배달 아울렛 놓고 약물을 혈관 적용할 단계 2.17에서에서 설명한 대로. 기존의 Ca2 + 이미징, 340/380 nm 빛 기름 침수 UV 목표 (예를 들어, 100 X, NA 1.3)를 통해 선박을 조명 하 고 수집 510에서 내보낸된 형광 광자 광 전 증폭 관 관 (PMT) 계산을 통해 nm. 각 실험의 끝에, 냉각 하는 MnCl를 포함 하는 솔루션으로 배 여 배경 형광을 측정 ( 표 1참조). 배경-수정 형광 비율 (R-F340/F380)를 사용 하 여 분석을 위해 또는 세포내 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]i)를 사용 하 여 변환할 R분 그리고 R최대 측정 (참조 표 1; 적용된 전에 냉각 하는 24) 및 Grynkiewicz 공식25. Confocal 캘리포니아2 + 이미징, Fluo-4 로드 혈관 자극 488 nm 및 캡처에 어느 라인에서 490-535 nm에서 결과 형광 방출 스캔 모드 (xt) 또는 xyt 스캔 모드 (512 x 512 픽셀, 제안된 pinhole 300 nm). 시간 t에 기록 하는 형광을 측정 표준화 = 0 (F/F0). [캘리포니아2 +]i 변화 약물 응용 프로그램 또는 가압 오프 라인으로 특정 지역에서 관심사 (ROIs)의 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 평가 합니다. 필요한 경우 Ca2 + 이미징 압력 myography를 수행 합니다.참고: 위의 설명은 unpressurized 혈관;에 대 한 최적화 되었습니다. 그러나 그것은 Ca2 + 이미징 압력 myography와 같이 결합 하 여입니다. 섹션 1에 의하여 arterioles 격리 합니다. 3.1-3.2 단계에 의하여 캘리포니아2 + 표시기 염료를 넣습니다. 녹음 실에는 arterioles 전송 및 2에 의하여 cannulate. 설치 절차 동안 빛에 노출 제한 하는 것을 주의. 측정 캘리포니아2 + 3.5 또는 3.7 위의 단계에 따라. 압력 선박 및 캘리포니아2 +. 의 측정을 반복 혈관 직경의 동시 측정 캘리포니아2 + 측정 및 장비 사용의 모드에 따라 달라 집니다.참고: confocal 캘리포니아2 + 측정에 대 한 그것은 필요할 수 있습니다 빛을 긴 노출 동안에 염료의 표백으로 인해 이미지 별도 지역 사전 및 후 가압 하. 4. 패치 클램프 전기 생리학 참고: 전체 셀 및 단일 채널 녹화는 개별 arteriolar 부드러운 근육 세포는 여전히 (를 사용 하 여 테이블의 자료에 대 한 자세한 장비)는 다음과 같이 그들의 부모 arterioles 내에 포함 된에서 가능 하다. 분리 하 고 1, 2.3 및 3.3 단계에 설명 된 대로 녹음 실에서 망막 arterioles 앵커. 패치 클램프 기록, 전표는 텅스텐 와이어 그릇 따라 200-800 µ m 간격 간격. 기저 lamina는 되 주변을 제거 하 고 인접 한 부드러운 근육 세포와 패치 클램핑 이전 기본 내 피 세포 전기 연결을 푸십시오. 이렇게 하려면 superfuse 효소 솔루션 (표 1) 필요한 동안 37 ° C에서의 순차적 시리즈와 선박.참고: 효소 노출의 기간 쥐 망막 arterioles 최적화 (효소, ~ 8 분, 콜라, ~ 12 분)와 약물 전달 시스템 (우리의 설정에 ~ 1 mL/min)의 흐름 속도 사용 되는 효소의 일괄 처리의 단위 활동에 따라 달라 집니다. 내 피의 시각적 분리에 소화의 수준을 평가 하 고는 콜라 동안 부드러운 근육 층 그림 4에 표시 된 단계. 세포 층의 분리 ( 그림 4B에서 같이) 관찰은, 일단 적용 DNAse I 솔루션 (~ 4 분) 다음 정상적인 Ca2 + 행 크 스의 솔루션과 목욕 솔루션의 교체에 의해 소화를 종료. 신중 하 게 그릇의 표면 따라 잘 집게의 닫힌된 끝을 스윕하여 기저 lamina 주변 neuropile의 모든 나머지 가닥을 제거 합니다. 당겨 유리 모 세관 (자료 테이블), 피 펫 솔루션 (표 1) 채우기 폴란드어 및 패치 클램프 headstage의 피 펫 홀더에 안전 하 게 장소. 녹음 실에 관하여 45 ° 각도로 피펫으로 놓고 동력된 micromanipulator에 거친 설정을 사용 하 여 선박을 향해 전진 합니다. 혈관 벽에서 튀어나와 부드러운 근육 세포를 선택 하 고 그 표면에서 볼 수 무료입니다 ( 그림 4B참조). 패치 피 펫의 끝의 셀 세로로 놓고 고를 micromanipulator의 벌금/느린 움직임을 사용 하 여 점차적으로 낮은 평활 근 막으로 접촉. 셀과 셀 운동과 수집 소프트웨어에서 막 (도장) 테스트 프로토콜을 사용 하 여 측정 피 펫 저항에 있는 변화에서 시각적으로 피 펫 사이의 접촉을 평가 (0에서 5-10 mV 부정적인 단계 mV, 주파수 25khz; 참조 그림 5A(i)) . 때 인감 저항 5-fold 증가 했다 (예를 들어, 10 m ω; 2에서 상승 그림 5A (ii)) 부정적인 압력 정도에 적용 y-커넥터, 3-방향 탭, 주사기와 피 펫 소유자에 연결 된 튜브를 통해 피 펫 소유자의 뒷면 ( 그림 1B를 참조 arterioles의 가압에 사용 되는 비슷한 방식으로 조립,). gigaseal까지 부정적인 압력의 반복 (> 1 GΩ 저항; 수집 소프트웨어에서 막 테스트에 표시 된 대로)가 형성 (그림 5A(iii)). Note,이 과정은 1-5 분 걸릴 수 있습니다. gigaseal 형태로 실패, 신선한 패치 피 펫을 사용 하 여 패치 클램프를 다른 셀을 선택 합니다. 잠재적인 지주 (일반적으로 0,-40 또는-80 mV) 수행 되는 실험에 의하여 수집 소프트웨어를 통해 셀에 적용 됩니다. 연구 (에 셀) 현재 구성에 단일 채널 활동. 또는, 빠르게 셀 표면에서 패치 피펫으로 gigaseal 형성 후 제거 하 여 완전히 패치를 생성 합니다. 막의 자유로운 끝이이 조건 하에서 다시 anneal 수 피펫으로 조작 (거친 설정)의 급속 한 수직 운동을 통해 목욕에서 제거. 피 펫 팁 내부만 패치를 떠나 개혁된 멤브레인을 제거 하는 초승달을 통해 신속 하 게 반환 합니다. 수집 소프트웨어 5 KHz를 샘플링 주파수를 설정 하 고 레코드 채널 활동을 연속 녹화 모드 활성화. 소프트웨어 또는 앰프를 통해 필요한 경우 전압 변경 적용 됩니다. 필요한 경우, 단계 2.17에서에서 설명한 선박/막 패치 약물 적용 됩니다. 막 스트레치가 필요한 경우 3-방향 탭 및 y-커넥터를 통해 압력 계에 부착 된 주사기를 사용 하 여 피 펫의 후부에 부정적인 압력을 적용 됩니다. 단일 채널 녹음 오픈 확률 및26표준 절차 따라 단일 계수에 대 한 분석. 전체 셀 현재 테이블의 자료에 의하여 풀 및 폴란드어 펫을 기록, 암포 B를 포함 하는 피 펫 솔루션 작성 (DMSO의 50 µ L에 암포 B의 3 mg을 추가 전체 셀 피 펫 솔루션의 1 mL를 3 6 µ L이 추가, 혼합 sonicate) 고 단계 4.6 4.9에 의하여 물개를 형성 한다. 암포 B의 포함으로 인해 전체 셀 액세스 피 펫 팁 내 막 파열 필요가 있다. 주어질 것 이다 점차적으로, 수집 소프트웨어에서 막 테스트 프로토콜을 사용 하 여 액세스를 모니터링 (-40에서-20 mV 단계 mV, 샘플 주파수 25khz; 그림 5B참조). 용량 성 과도 일부 소프트웨어에서의 자동화 된 피팅 액세스 저항 및 셀 커패시턴스 (또는 과도의 상대적 감소 평가 될 수 있다 눈으로)의 실시간 측정을 생성 합니다. 일단 액세스 저항 < 15 m ω가, 시리즈 저항 보상 (그림 5C) 앰프에 전체 셀 매개 변수 다이얼 (커패시턴스와 직렬 저항)을 사용 하 여 수행 합니다. 이렇게 하려면 자동된 피팅 값 초기 설정 다이얼 ( 그림 5C(ii) 참조)를 사용 하 여 다음 시리즈 저항 보정 다이얼 (예측 및 수정 앰프에서 사용 가능한 경우)를 증가 전체 셀 보상을 재정리 용량 성 과도 줄이면서 ( 그림 5C(iii) 참조). 하지 통해 보상 ( 그림 5C(iv)에서 같이)를 돌보는. 일반적으로, 직렬 저항 천공된 패치 모드 (최대 설정에 대 한 지연 보상 필요)에서 75%로 보상 가능 하다. 사용할 수 없는 자동된 피팅 이면 설정 전체 셀 매개 변수 15 pF와 15 ω (일반 값이이 셀에 대 한) 다이얼 고 다음 그림 5C(ii)와 같이 출력을 생성 하 여 시작 합니다. 시리즈 저항 보정 다이얼 ~ 75%로 증가 하 고 그림 5C(iii)에 의하여 전체 셀 매개 변수 다이얼을 조정. 실험 시작 전에 수동 보상 후 셀 커패시턴스 측정 초기 자동된 피팅 또는 다이얼에서 note.참고:이 값 셀 크기에 전류를 정상화 하는 데 사용 됩니다. 직렬 저항에 대 한 보상은 액세스 패치도 암포 B의 추가 설립으로 개선 하기 위해 계속 수 실험 중 조정 될 필요가 있습니다. 2.17 단계에서 설명한 대로 약 배 적용 됩니다. 실험 요구 사항에 따라 전압 프로토콜 (단계 또는 경사로)를 적용 합니다.참고: 일반 전압 단계 프로토콜, 0.1-1 기간, s는 지주 로부터 적용 됩니다 10-20 mV에 잠재력 증가 마다 5-10 s 전류 전압 활성화의 제품군을 생산 하. 또는 램프 프로토콜을 사용 하 여 천천히 전압을 램프에 의해 하나의 ‘스윕’ 전압의 시리즈에서 전류를 측정 (100-200 mV/s)에서 예를 들어, 80에-80 mV (모든 5-10 s 적용) 경사로 동안 10 mV 간격 현재 오프 라인 샘플링. 패치 클램프 기록 다음과 같이 Ca2 + 이미지를 결합 하는 것이 가능 하다. 섹션 1에 의하여 arterioles 격리 합니다. 3.1-3.2 단계에 의하여 캘리포니아2 + 표시기 염료를 넣습니다. 섹션 4에 의하여 녹음 실에서 탑재 합니다. 이 절차 동안 빛에 노출 제한 하는 것을 주의.참고: 그것을 날짜를 하지 않은 압력 myography 연구는 지하실 멤브레인와 선박 무결성의 손실 때문에 효소 분리 과정에서 하는 패치 클램프 결합 가능