全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

本研究は、WSLHD 人間研究倫理委員会 (HREC) (承認 AU レッド HREC/15/WMEAD/289) によって承認されています。 1. 全血フローサイトメトリー用試料 注: 人間の血液は感染の危険性、サンプル セットアップはバイオハザード フード実行必要があります。 参加者から 3 mL エチレン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) チューブに血液サンプルを収集します。 血球計数装置または検定を使用して白血球 (WBC) 数を決定します。 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 5 〜 10 倍に濃度を調整する (pH 7.4 〜) に希釈6 WBC/mL。 (マスター ミックス x 16 の準備など14 管) 管の数を 50 μ L の血液量、抗 CD14 V450 0.75 μ L、0.5 μ L 抗 CD16 APC、0.625 μ x 16 を組み合わせることにより十分なマスター ミックスを準備 HLA DR PerCP アンチ。各チューブ (表 1) にミックスの渦とピペット 51.9 μ L注: 抗体は蛍光抗体の至適染色濃度を決定する滴定する必要があります。 表面マーカー (M1 や M2 アイソタイプ コントロール、フィコエ リスリン (PE) ラベル) を追加 (例表 2に従って) 抗体と PE 標識 (CD3) T 細胞、B 細胞 (CD19)、好中球 (CD66b) のためのマーカーとナチュラル キラー (NK) 細胞 (CD56) (表 3)。渦と暗闇の中で 4 ° C 30 分間インキュベートします。注: リンパ球、好中球、NK 細胞のマーカー、ゲーティング法の検証についてのみ含まれます。 結合赤血球溶解/WBC 定着液、優しくすぐに、渦の 250 μ L を追加し、4 ° C で暗闇の中で 10 分間インキュベート 室温で 10 分間 260 x gで 250 μ L の PBS とスピンのセルを追加します。 上清を除去、再 1% のホルムアルデヒドの 300 μ L のセルを中断します。注: ホルムアルデヒドは有毒です。ニトリル手袋、発煙のフードで使用します。 解析が実行されるまでを光から保護 4 ° C で保存します。注: サンプル調製の 48 時間以内に完了するには、フローの分析の使用をお勧めします。 2. フローサイトメトリー チェック施設スタッフを確保するための流れの cytometer ログは品質管理のチェックを実行しています。注: 一貫した解析、計測器品質管理と維持の整合性を確保するには、対象の蛍光強度制御ビーズを使用してお勧めします。 流れの cytometry 実験を設定、するをクリックして”新しい実験し、「新しい見本」と「新しいチューブ」チューブを追加します。アイコンをクリックして 2 変量プロットを選択し、軸パラメーターを選択するドロップ ダウン メニューを使用します。CD16/CD14 プロットと買収を監視する時間と一緒に検出器を表示するプロットを含めることを確認します。 チューブを挿入し、「取得」をクリックします。検出器信号がスケールをオフではないことを確保する機器の電圧設定を確認します。 CD14/CD16 プロットの単球ゲートに落ちる細胞を観察します。古典的な単球ゲートの 5,000 イベント記録しきい値を設定し、「記録」をクリックします。 残りのチューブのデータを記録し続けます。すべてのチューブのデータが記録されている後は、分析のための .fcs ファイルとしてフロー データをエクスポートします。注: 精度を確保するには、単一のカラー補正コントロールを記録すべき。補償行列を計算して15,16にスペクトルの流出を考慮する解析の前にデータに適用できます。 3. 単球ゲート 解析ソフトウェアでファイルを開きます。管名と前方散乱領域 FSC (A) の細胞を可視化する/高さ FSC(H) 散布するドロップ ダウン メニューから選択パラメーターをダブルクリックします。ダブレット除外ゲートを作成するには、多角形のゲートのツール アイコンをクリックして (図 1 a) のように細胞を囲みます。 ゲートのセルを選択 (ダブル クリック ゲート領域) から、新しいディスプレイでボックスが FSC (A) のセルを表示するドロップ ダウン メニューのパラメーターを調整/側方散乱 SSC(A) プロットします。長方形のゲートのアイコンをクリックし、惜しみなくリンパ球、NK 細胞、顆粒球 (図 1 b) の大半を除外する前方および側面拡散プロパティに基づいて単球人口を選択します。 ゲートのセルを選択し、ドロップ ダウン メニューを使用してパラメーターを選択する CD14/CD16 プロットを再表示します。多角形ゲート特性「┐」形 (図 1) に基づく単球を選択するをクリックします。 ゲートのセルを選択し、パラメーターを選択するドロップ ダウン メニューを使用して、CD16/HLA-DR プロット上、単球を表示します。HLA-DR 陽性細胞を選択、残り NK 細胞と好中球17 (図 1) を排除する多角形ゲートをクリックします。 ゲートのセルを選択し、ドロップ ダウン メニューを使用してパラメーターを選択する CD14/HLA-DR プロットの HLA-DR 陽性細胞を表示します。多角形ゲートをクリックし、HLA-DR 高/CD14 低細胞 (B 細胞は HLA がない CD14 の高レベルを表現) を除外するゲートを引く (図 1E)。注: B 細胞汚染が発生し、したがって、調査する必要があります。図 1の非古典的な人口は、異なるセルの左側には、汚染が可能性があります。B 細胞非古典的な単球と重複していない場合、3.5 のステップをスキップできます。 ゲートのセルを選択し、ドロップ ダウン メニューを使用して、CD16/CD14 プロット上に表示。プロット オプションから「ゼブラ プロット」サブセットの割合 (図 1 f) を決定する描画する単球サブセット ゲートを可能にするを選択します。注:ゼブラ プロットは擬似カラー (スムース) の解析ソフトウェアで使用可能なかどうか、またはコンター プロットが適さない場合があります。 長方形のゲートのアイコンをクリックし、CD14 CD16/高低、古典球人口のまわりのおおよそ長方形ゲートを描画することによって古典的な単球を選択します。「中央分離帯を表示する」を選択「表示」の下で古典的な単球の平均蛍光強度を表示します。人口が左にセルをすべて含む左右の中央から均等にゲートを調整します。 古典的なゲートの右側にセルを含む長方形ゲートを描画することによって中間の人口を選択します。により、中間のサブセットに匹敵する CD14 式古典球のゲート内に完全にある同心円の下部に門を合わせ、クラシック以外のセルを除外するゲートの底を調整、現在の名目で一貫性のある主要な古典的な人口。 非古典的なサブセットをゲート人口 (図 1 f) の下のすべてのセルを選択する、中間のサブセットの下端から下の長方形のボックスを描画します。 「ゲートの周波数を表示する」を選択「表示」の下で各 monocyte のサブセットの割合を決定します。 4. ゲーティング法の検証 潜在的汚染の種類の細胞が効果的にゲート アウトであるかどうかを調べるには、まず T 細胞 (サブセット CD3)、B 細胞 (CD19)、(CD66b)、好中球、NK 細胞 (CD56) に対する抗体で異なる細胞集団を特定 (図 2)。注: ここで T 細胞と好中球単球の「┐」図形の近くに座っていないと図 1にいるゲートします。 NK 細胞は 3.4 (図 1) の手順で削除された B 細胞は、図 3に示すように、ステップ (図 1E) 3.5 で削除されますを確認します。NK 細胞または B 細胞のゲート外でできない場合は、ゲートを再調整します。 5. 表現型単球マーカー式 各 monocyte のサブセットからセルを選択します。各 monocyte のサブセット (図 1 f) の各マーカーとそのマッチング アイソタイプ (図 4) を表示するヒストグラムを作成するパラメーターのドロップダウン リストを変更します。 それぞれアイソタイプ コントロールと比較してそれぞれのマーカー (中央値または幾何学的平均値) の式の次数を計算します。