人間の脂肪のための Microphysiologic プラットフォーム: 白色脂肪組織に挟まれた
Summary
白色脂肪組織 (WAT) には、薬理学的開発と代謝の研究を妨げる現在初代培養のモデルの重大な欠陥があります。ここで間質細胞のシートの間に挟むワット脂肪 microphysiological システムを生成するためのプロトコルを提案する.このコンス トラクターは、ワットの一次文化のため安定的かつ適応可能なプラットフォームを提供します。
Abstract
白色脂肪組織 (WAT) は、重量と毎日の健康の調節に重要な役割を果たしています。 まだ、忠実に脂肪の微小環境を要約またはワット 2 週間を超えて生存を拡張に失敗したすべての利用可能な初代培養モデルに大幅な制限があります。 信頼性の高い培養モデルの欠如は深刻なワット代謝および医薬品開発の研究を妨げます。このため「SWAT」(サンドイッチ白色脂肪組織) と呼ばれるワットの一次文化のための新規プラットフォームを開発する microphysiologic システムの NIH の基準を活用しています。我々 は、みじん切りのワット クラスター脂肪由来間質細胞のシートの間に挟むによって脂肪細胞の自然な浮力を克服します。 このコンス トラクターには、ワットのサンプルは、文化の実行可能な以上 8 週間です。 SWAT そのまま ECM、細胞-細胞間の接触、ワット条件体内の物理的な圧力を維持します。また、SWAT は、堅牢な転写プロファイル、外因性化学シグナリングと全体の組織の機能に対する感度を維持します。SWAT は、脂肪培養の再現性のある、シンプルで効果的なメソッドを表します。 潜在的に、ワット生理学、病態生理、代謝、及び医薬品開発の研究のための広く適用可能なプラットフォームです。
Introduction
脂肪は肥満は、米国1の $ 1470 億と $ 2100 億との間の直接の年間医療費を運ぶの主な臓器です。脂肪の蓄積は、心臓病、II 型糖尿病、特定の種類のがん2などの死の他の原因にもつながります。文化モデルの in vitro代謝の研究と医薬品開発に不可欠なが、現在の研究モデル脂肪組織の主要な不足があります。脂肪細胞は壊れやすく、軽快な, と終末分化した細胞細胞培養プラスチックを遵守しない、従って従来の細胞培養法を用いた培養することはできません。1970 年代、いくつかの方法がガラス coverslips、天井文化、懸濁培養細胞外マトリックス3,4,5,の使用を含む、これらの障壁を克服する試みで使用されています。6,7します。 ただし、これらのメソッドは、細胞死と脱分化、によってマークされていると、彼らは通常以上の 2 週間の研修期間に使用されます。さらに、これらのモデルがしないでそのまま ECM は保持していません、脂肪細胞と間質の相互作用サポート細胞も収縮力細胞を互いにで生体内で発揮ネイティブ脂肪微小環境を再現ワット。
ゴールド スタンダード脂肪培養法のない場合は、脂肪の研究は分化前脂肪細胞 (diffAds) の主に頼っています。DiffAds は多房性、付着性、および代謝活性です。対照的に、プライマリの白色脂肪細胞は単房性、非粘着性と比較的低代謝を示します。健康な成熟脂肪組織の生理を要約する現在脂肪培養モデルの失敗は、脂肪細胞を直接対象とする FDA 承認薬の不在で主要な要因では可能性が高い。実際には、生理学的体外臓器モデルの欠如は、ほとんどの臓器や疾患にわたって主要な問題です。
Microphysiological システム (MPS) プログラムの創設を発表したそのポジション ペーパー、国立衛生研究所 (NIH) 報告医薬品臨床試験のすべてにわたって 2013年成功率もすぎなかった 18 のフェーズ II の %、第 III 相 50%臨床試験8。MPS プログラムは、直接体外単作のモデル人間の生理にできないことに対処するためです。NIH は、人間のプライマリまたは器官の機能を要約するだろう多細胞の 3 D 構造で幹細胞から成る文化システムとして MPSs を定義します。同質で、不死化細胞培養の還元主義的モデルとは異なり MPSs をオルガン薬物相互作用9薬物、薬セル セル セル正確にモデルする必要があります。短期の初代培養方法とは異なり NIH の基準は文化8で 4 週間にわたって MPS 持続可能性を指示します。NIH の RFAs (#RFA-TR-18-001)10MPS プログラムの詳細を見つけることが。
適応可能な単純な小説を開発した、安価な脂肪の MPS は「白色脂肪組織に挟まれた」と呼ばれる (SWAT)11。私たちは「挟む」みじん切りにした主な脂肪脂肪由来間質細胞 (ADSCs) (図 1) のシートの間で脂肪細胞の自然な浮力を克服します。結果として 3 D 構築サポート セル人口は自然な脂肪細胞と成熟脂肪細胞を囲む細胞間接触とネイティブ脂肪微小環境を繰り返します。SWAT は、8 週間生存率、外因性シグナリング、アデポカイン分泌と動物モデルに生着する応答を実証によって検証されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの詳細 ADSCs を使用してサンドイッチひと白色脂肪組織;人間 ADSC 細胞は十分に確立されたプロトコル15を介して分離できます。ただし、システムは個別研究の要件 (サンドイッチ マウス ワット 3T3L 1 セルを使用して) などの適応することができます。主な人体組織にはこのプロセスが含まれます。標準的な安全上の注意を採用する必要があります。BSL 2 病原体 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ルイジアナ州立大学健康科学センター、プロジェクトに資金を提供によって提供される制度上のサポートを確認したいと思います。
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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