用质谱和电镜分析 Biolayer 干涉传感器上的动态蛋白复合物的组装和释放

这一演示说明了如何使用 biolayer 干涉仪, 用 EM 可视化的方法来方便地监测大分子复杂地层, 并在短时间内对 microvolumes 进行了验证。结构组装和观测到的复合体遵循生物相关的预测, 进一步验证了这种组合方法。如结果部分所述, 组装成功的关键因素需要合理地设计半胱氨酸突变, 以确保复杂的蛋白质-蛋白质界面能正确地定向远离生物传感器表面。

以前的系统已经使用 BLI 和 MS 技术来评估两个和三组分系统的蛋白质结合以及表达蛋白的受体结合的完整性, 但在这两种情况下, 都没有开发出利用串联 EM 和 ms 的方法。接近^8,9。唯一的其他干涉系统, 结合 MS 分析, 以帮助表征相互作用是双重极化干涉测量¹⁰。不幸的是, 这个系统已不再适用于一般用途。正如导言中所提到的, 已经完成了一些研究, 其中样本是在 spr 型生物传感器表面形成的, 并从 MS 分析中去除。这些例子中没有一个结果是用 EM 可视化的复合体。

这种顺序方法的局限性可以是很多的, 但是可解的。对于装配初期的固定化和基础步骤, 缺乏对结构相互作用表面的知识肯定会阻碍与监测初始装配阶段有关的进展。结构信息的缺乏可以通过设计一个工程基础结构来解决, 其中附着化学 (如硫醚的巯基基团/他标记的定位) 可以移动到核心中的各个区域。装配系统。在炭疽毒素复合体的情况下, 幸运的是, LF_N的结构与 PA_prepore是可用的¹¹。将工程半胱氨酸的合理位置定位到远离 PA_prepore结合面的区域。与半胱氨酸连锁化学, 最好的是没有其他反应半胱氨酸在蛋白质表面存在。

有各种附着化学物, 可用于在蛋白质表面上设计特定的附着部位。最受欢迎的特定附件之一是将生物素基团放置在蛋白质表面¹²的特定位置上。不幸的是, 生物素结合到链亲和素或亲和涂层表面是相当紧密的。反向绑定交互并不简单。在 N 或 C 终点使用工程化的他的标签, 随后容易附着到镍 NTA 表面上, 是一种更为普遍的亲和固定化应用。当然, 工程装配附件站点与他标记的系统的一个警告是要求核心装配蛋白的 N 和 C 终点保持暴露和分离, 以便附件是容易的。与所有的装配过程一样, 核心组装蛋白的相互作用界面必须在复杂的组件进展时保持可用。

也许使用生物传感器表面化学的最常见的问题是非特定的结合。链亲和素提示通常是重要的非特定绑定效果的来源。二硫化物链接生物素可以用来释放非常具体的复合物留下的减少 S-生物素联系紧密绑定到固定化链亲和素生物传感器¹³。还有其他可逆化学制剂, 如 iminoboronates 和在较小程度上 ketoamide¹⁴。这个领域目前不发达, 但有很大的兴趣进一步发展可逆的共价键, 以避免非靶向药物毒性效应, 通常伴随使用共价靶向药物开发。

使用 EM 来可视化复合物的限制是解释, 特别是在组装复合体的结构最初不知道的情况下。用单克隆抗体作为特定的动力学和结构标记, 可以识别未定义的组装大分子复合物中元件的空间位置。例如, 一旦形成一个复杂的, 单克隆抗体可以添加绑定到特定的组件。此方法经常用于 EM 以识别大型组件¹⁵中的特定组件。另一个限制与复合体的大小有关, 尽管有实例, 即定义的对称程序集小到 70 kDa (GroES heptamer) 很容易用负污点 EM 解决。由 EM 分析的组装配合物通常在直径或以上的100Å的大小范围内。然而最近, 20 kDa 的蛋白质已经得到了解决, 并且在使用高级染色方法¹⁶时获得了低分辨率结构。

对于 ms 分析, 目前 ms 仪器的灵敏度提高到 femtomolar (attomoles) 水平, 在某些情况下可以提高 BLI 检测的灵敏度。很有可能的是, 蛋白质信号, 显示一个极小的, 但可重复上升的振幅将导致识别的蛋白质的问题。此外, 探讨蛋白质与蛋白质的相互作用, 其中一个伙伴附着在生物传感器和其他在细胞环境中, 将有效地导致净化和随后更容易检测新形成的复杂。目前高度敏感的 MS 系统可以观察到的一个局限性是, 感兴趣的蛋白质可能不在数据库中, 但这种观察是罕见的 (例如,稀有物种的蛋白质组)。如果有兴趣的蛋白质序列已知, 这个问题很容易解决, 包括蛋白质 (s) 氨基酸序列的背景蛋白数据库 (如本工作在协议部分)。这种方法的另一个潜在的局限性是由蛋白质对 trypsinolysis 的抵抗力造成的。胰蛋白酶消化通常是自下而上蛋白质鉴定的默认方法。然而, 蛋白质可能对胰蛋白酶有抗药性, 如果他们缺乏 Arg 和赖氨酸残留物或获得这些残留物受到折叠结构的限制。这些限制分别是通过使用替代或组合蛋白酶或包括展开试剂 (如1.1.14 和1.2.6 中所示) 在酶消化之前。

这种方法的可能扩展包括允许用户跟踪和识别来自粗细胞裂解物的细胞组装复合物。结果表明, 在浓缩细胞萃取物中组装元件的测试很容易使用 biolayer 干涉测量程序进行。与更常用的基于微流控的方法相比, 容易堵塞和对聚集敏感, BLI 方法可用于直接将 biolayer 传感器提示浸入粗萃取物中, 从而有可能直接装配特定的络合物。从这些浓缩的不纯样品。一旦组装, 使用特定的抗体探针作为 BLI 系统的后续行动是完全可行的, 以进一步识别, 甚至定量可疑成分的细胞提取物, 已识别使用 microvolume MS 方法。再次, 这里的关键是使用定义的, 适当地定向核心蛋白作为特定的亲和探针。

动力学与 BLI 的 prepore 孔过渡过程的能力, 将非常有用的发现潜在的 “抗毒素” 小分子抑制剂的蛋白质转变, 特别是功能在后期细胞膜, 低 pH 值 (5.0)条件。这种 pH 诱导的 prepore 孔转变是抑制在存在的折叠稳定剂 (渗透调节物质), 如甘油或蔗糖, 从而为开发特定的目标折叠稳定剂, 以防止 PA_孔形成的强大支持。这种特殊的方法避免和取代了基于粗糙聚合的化验, pH 值下降导致蛋白质沉淀。后一种方法, 虽然很好的主要预检方法, 往往导致假阳性结果, 其中特定化合物抑制聚集, 而不是实际的分子转变。

下游观测的结构和鉴定的个别组装部件在小 microvolume 样品也可以用于验证潜在的铅化合物。在特定的程序集稳定或不稳定是目标结果的情况下, 可以应用此方法。这种动力学/结构/识别并行方法有助于直接确认可疑铅复合效应剂的有效性, 并作为一个合理的二次筛选步骤或中等吞吐量方法。

低温 EM 是研究不同组装状态下大分子络合物的原子细节的一种有用的技术。在制备低温 em 样品之前, 首先要验证制备中是否含有带有负染色的纯同质复合物。本文介绍的工作表明 BLI 生物传感器表面的蛋白质复合物的组装, 这些配合物的释放为 EM 可视化, 并使用 MS 识别这些成分。这种控制装配和释放的特殊方法可以用于生成非常具体的协议, 以增强对负染色 EM 的均质序贯样品准备, 这是必须在推进到冷冻 EM为了获得低分辨率的3D 结构, 只有30-50 粒子的复杂将需要执行一个圆锥倾斜系列 (70 不同的2D 图像视图每个粒子), 只要有方向多样性 (多个不同的看法)。

在提高 MS 方法方面, 灵敏度和样品量减少的进展继续改善。纳米流与超高压液相色谱法一起开发了质谱仪, 具有快速的工作周期, 提高了灵敏度和分辨力。最近介绍的 orbitrap 质谱仪, 特别是最新版本 (orbitrap 融合 Lumos, 及其预期的后继者 orbitrap 融合 Lumos 1M) 以及搜索算法极大地促进了这一过程。

目前的方法是使用无标签的 BLI 方法监测炭疽毒素成分的动态组装和拆卸, 并分别使用 EM 和 MS 对这些组分的结构和特性进行评估。采用简单的单通道 BLI 系统, 加上常规的负染色 EM 分析和初等 MS 技术, 足以表征装配过程。