Long-term <em>In Vivo</em> Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within <em>Drosophila</em> Pupae

Helen Weavers; Anna Franz; Will Wood; Paul Martin

doi:10.3791/57871

JoVE Journal > Immunology and Infection

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免疫与感染

Langfristig In Vivo Verfolgung von entzündlichen Zelldynamik in Drosophila Puppen

Published: June 14, 2018

doi:

10.3791/57871

Helen Weavers^1,2, Anna Franz¹, Will Wood³, Paul Martin^1,4

¹School of Biochemistry, Biomedical Sciences,University of Bristol, ²School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences,University of Bristol, ³MRC Centre for Inflammation Research,University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, ⁴School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences,University of Bristol

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die live-Imaging Wunde Reparatur und der damit verbundenen entzündlichen Reaktion bei hoher räumlich-zeitliche Auflösung in Vivo. Diese Methode nutzt das Puppenstadium Drosophila Entwicklung ermöglichen langfristige imaging und Verfolgung von bestimmten Zellpopulationen im Laufe der Zeit und ist kompatibel mit effizienten RNAi vermittelte gen-Inaktivierung.

Abstract

Während die rasche entzündliche Reaktion auf Gewebeschäden sind Zellen des angeborenen Immunsystems schnell zur Verletzung Aufstellungsort rekrutiert. Einmal an der Wunde führen angeborene immune Zellen eine Reihe von wesentlichen Funktionen, wie z. B. Bekämpfung von Infektionen, clearing-nekrotische Schutt und anregende Matrix Deposition. Um die vielfältigen Signalisierung Veranstaltungen zu verstehen, die diese Immunreaktion regulieren, ist es wichtig, die komplexen Verhaltensweisen von (und Interaktionen, die zwischen auftreten) beobachten mehrere Zelle Linien in vivo und in Echtzeit mit den hohen räumlich-zeitliche Auflösung. Die optische Durchsichtigkeit und der genetischen Lenkbarkeit von Drosophila Embryos haben Drosophila als von unschätzbarem Wert-Modell zum live-Bild und sezieren grundlegende Aspekte der entzündlichen Zelle Verhalten, einschließlich der Mechanismen der Developmental Zerstreuung, Räumung von apoptotischen Leichen und/oder mikrobiellen Krankheitserregern und Rekrutierung von Wunden. Jedoch neuere Arbeiten hat nun gezeigt, dass mit einem viel späteren Stadium im Lebenszyklus Drosophila – Drosophila -Puppe – eine Reihe von Vorteilen bietet, einschließlich der RNAi-Effizienzsteigerung, längere Perioden, imaging und deutlich größere Immunzelle Zahlen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur bildgebenden Wunde Reparatur und der damit verbundenen entzündlichen Reaktion mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung in live Drosophila -Puppen. Um die Dynamik der Re Epithelisierung und Entzündungen zu folgen, verwenden wir eine Reihe von spezifischen in Vivo fluoreszierenden Marker für das Epithel und angeborenen immunen Zellen. Wir zeigen auch die Wirksamkeit von Foto-Cabrio Fluorophore wie Kaede, für folgende spezifische Immunzellen Teilmengen, um ihr Verhalten zu verfolgen, wie sie auf, zu migrieren und Entschlossenheit aus Verletzung Aufstellungsort.

Introduction

Eine effiziente und effektive entzündliche Reaktion ist von zentraler Bedeutung für jeden Organismus Infektionen bekämpfen, klar, Schutt und orchestrieren die Reparatur des verletzten Gewebes¹. Obwohl diese Reaktion ein unvermeidliches Ergebnis der meisten Gewebeschäden ist, erfordert Entzündung strenge Regelung denn eine unangemessene Entzündungsreaktion mit einer Vielzahl von verschiedenen Krankheiten des Menschen (einschließlich chronische nicht-heilende Wunden verbunden worden ist übermäßiger Narbenbildung und Prädisposition für Krebs)¹^,²^,³. Diese klinischen Relevanz gegeben, ist es entscheidend, ein genaueres Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen fahren die entzündliche Reaktion um neue prognostische Indikatoren und Strategien zur Behandlung von unterschiedlichsten chronischen entzündlichen entwickeln zu erhalten Bedingungen, die Reparatur von Gewebe von einer längeren und unnötige Entzündung schützen könnte.

In den letzten Jahren geworden Drosophila etablierte und wertvolle Modellsystem, Grundzüge der entzündlichen Reaktion auf menschliche⁴^,⁵von Insekten konserviert zu zergliedern. Drosophila bietet weitaus größere genetische Lenkbarkeit als bisher in anderen experimentellen Modellen (z.B. Mäuse oder Zebrafisch) erlaubt präzise räumlich-zeitliche Genmanipulation in Vivo (inaktivieren oder über express jedes Gen des Interesses in bestimmten Zelltypen zu einem definierten Entwicklungs-Zeitpunkt) und Leichtigkeit der genomweiten Bildschirme⁶^,⁷. Traditionell wurden die meisten live-Imaging-Studien der Heilung von Wunden und Entzündungen in Drosophila in einem embryonalen Stadium durchgeführt wie Embryonen unbeweglich (im Gegensatz zu Drosophila Larven oder Erwachsene) und optisch transparent ermöglicht beispiellos hohe Auflösung in Vivo imaging-⁸. Dies hat es erlaubt Forschern, die schnelle und robuste Einstellung von Drosophila angeborenen immunen Zellen (Hemocytes) an der Wundstelle als Reaktion auf die mechanische oder Laser-induzierte Schädigung der embryonalen Epithel⁹^, zu visualisieren ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. durch die Kombination dieser live-Imaging-Studies mit der genetischen Manipulation, Studien bei Drosophila Embryos haben viele wichtige Immunzelle Proteine, die entzündliche Zelle Verhalten in VivoSteuern entdeckt. Zum Beispiel die CED-1 Homolog Draper (ein ITAM Domäne-haltige Protein) identifiziert worden als eine wichtige beschädigen-Rezeptor vermittelt, dass die Rekrutierung Drosophila Immunzellen ein H₂O₂-abhängigen Weise zu Stätten der beschädigen Sie¹⁵. Draper Ebenen innerhalb Immunzellen werden wiederum durch Kalzium-induzierte JNK Signal- und erhöhten flussabwärts von apoptotischen Leiche Aufnahme¹²geregelt. Hemocyte Motilität weiter erfordert komplexe Zellskelett Änderungen gerichtete Migration in die Wunde zu koordinieren und ist abhängig von der Aktivität des Zytoskeletts Regulierungsbehörden wie der Aktin-Bündelung Protein Fascin¹⁶ und der Rho-Familie kleiner GTPasen Rac und Rho⁹.

Drosophila ist ein holometabolous Insekt, die durch die zusätzliche Larven und pupal Stadien nach Embryogenese, vor dem Erreichen des Erwachsenenalters¹⁷geht. Die Drosophila -Puppe wurde entwickelt als ein zusätzliches Modell für nicht-invasive Leben-Aufnahmen von einer Vielzahl dynamischer zelluläre Ereignisse, einschließlich developmental Cell Migration¹⁸, Zellteilung¹⁹, Zelle Wachstum²⁰und Muskel Kontraktion²¹. Vor kurzem wurde es als eine neuartige Modell, in dem die Dynamik der Wunde Reparatur und Entzündungen in Vivo²²^,²³eingerichtet.

Genau wie in der embryonalen Phase sind Drosophila Puppen unbeweglich und optisch transparent, nach sorgfältiger Präparation aus ihrer undurchsichtigen pupal Fällen¹⁸. Durch die Nutzung dieser optischen Transparenz, kann man das in Vivo Verhalten des angeborenen immunen Zellen (Hemocytes) als Reaktion auf Gewebeschäden in Drosophila pupal Geweben, wie z. B. die pupal Flügel²²folgen. Die pupal Flügel existiert als eine einfache bilayered Struktur, bestehend aus zwei großen flachen epithelialen Blätter, die an der Peripherie des Flügels verbunden sind; die extrazelluläre Raum zwischen diesen beiden epithelialen Schichten ist voller Hämolymphe (Insekt Blut) und eine große Zahl von bewegliche Hemocytes²⁴. Ebenso wie in Embryonen löst mechanische oder Laser-induzierte Schädigung der Flügel Epithel eine schnelle Rekrutierung von Hemocytes bis die Verletzung Seite²³. Das Puppenstadium bietet jedoch einige deutliche Vorteile für die Bildgebung über früher embryonalen Phase. Verletzte Puppen können über viel längere Zeiträume (für mindestens 5 h) abgebildet werden, mehr Gewebebereich steht der experimentellen Störung (z. B. Erzeugung von mehreren Wunden) und gibt es wesentlich größere Zahl von Hemocytes an dieser Bühne ( Bereitstellung von mehr Zelle Flugbahnen aus weiter Entfernung für verbesserte statistische Aussagekraft während der mathematischen Analysis). Darüber hinaus ist die Effizienz der RNAi-vermittelten gen-Inaktivierung in pupal Stadien, so dass viele Gene “in einem Gewebe oder die Zeit-spezifische Art und Weise im Vergleich zu den traditionelleren ganze mutierten Ansatz der Embryonen geworfen werden” erheblich verbessert.

Um die Dynamik der Wunde Re Epithelisierung und die begleitende Entzündungsreaktion innerhalb dieses neuen pupal Modell zu folgen, müssen zwei unterschiedliche Zellpopulationen gekennzeichnet werden: das pupal Epithel und die angeborenen immunen Zellen (Drosophila Hemocytes). Eine Reihe von verschiedenen Markern (Table of Materials) sind diese beiden unterschiedlichen Zellpopulationen zu beschriften – die Wahl des Markers hängt von der bestimmten Prozess untersucht werden. Anlässlich der pupal Epithel, Drosophila Zeilen, die entweder werden ein ubiquitär ausgedrückt GFP-Tags E-Cadherin (das Adherens Junctions Etiketten) routinemäßig genutzt, um die Positionen von den Zellenrändern oder alternativ ein GLP-Tags angeben Actin-bindende Domäne des Moesin (das das Aktin-Zytoskelett Etiketten), die Wunde-Rand kontraktilen Aktin Ring und führende Vorsprünge zu visualisieren. Die Drosophila Hemocytes, ein Hemocyte-spezifische Srp-Gal4²⁵ Antrieb Ausdruck des nuklearen RFP (für nukleare Tracking), zytoplasmatischen GFP oder GLP-markierten Moesin (Zytoplasma oder Aktin-Zytoskelett, bzw. beschriften) beschriften oder eine Photoconvertible Fluorophore (z. B. Kaede) dienen. In der Tat ist es oft vorteilhaft, mehrere Immunzelle Marker in Kombination verwenden, um simultane Analyse von der Atom-Bewegung und der Zellmorphologie (siehe repräsentative Ergebnisse) zu aktivieren. Da dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Puppen beinhaltet, werden jedoch nur Kombinationen von genetischen Markern, die tragfähige bis Mitte pupal Stadien genutzt werden können. Darüber hinaus werden embryonale tödliche Aktien nicht geeignet. Dies ist unwahrscheinlich, dass ein Problem sein, wenn bildgebende Kontrolle (oder Wild-Typ) Puppen aber ist wichtig zu berücksichtigen, wenn Gene sollen abgerissen werden oder überexprimiert, um ihre Auswirkungen auf den Wundverschluss oder Entzündung zu beurteilen. Bei frühen Letalität verursacht durch gen-Knockdown (oder Überexpression), eine Gal80^ts Konstrukt kann induzieren die Gal4-driven Zuschlag später in der Entwicklung verwendet werden (siehe Diskussion).

In unseren jüngsten Studien hat Einzug in das Puppenstadium ermöglicht Datenerfassung ausreichend Immunzelle Flugbahn um entzündliche Verhalten mit anspruchsvolle mathematische Modellierung, der wiederum neue Details der Wunde ableiten konnte zu analysieren entzündlichen Lockstoff signalisiert²³. Zum Beispiel offenbart dieser Ansatz, dass die Wunde lockstoffgradient breitet sich langsam durch das entzündete Gewebe bei 200 μm2/min, einer Rate weit langsamer als bisher vorgeschlagen kleine Kandidat Moleküle wie ATP oder H₂O₂ gemeldet werden diffuse²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹; Diese kleine “Schäden” Moleküle sind stattdessen wahrscheinlich als freizügige Signale handeln. Darüber hinaus folgt das langfristige Verhalten der angeborenen immunen Zellen wie sie weg von einer anfänglichen Wunde lösen und eine zweite (gemacht an verschiedenen Zeitpunkten nach der ersten) ausgesetzt sind, haben wir einen temporären “Desensibilisierung” Zeitraum, in denen Immunzellen entdeckt sind blind für spätere Verletzungen²³. Durch Nutzung des langfristigen bildgebenden Potenzials des Modells pupal zusammen mit Drosophila genetische Lenkbarkeit, kann man das Verhalten von bestimmten Immunzellen Populationen (z. B. nur jene Immunzellen an der Wundstelle rekrutiert) in folgen. Antwort auf nachfolgenden Beleidigungen, mit der Photoconvertible Fluorophor³⁰ , die ausschließlich innerhalb der Immunzelle Linie²³ausgedrückt werden kann.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Dynamik der Wunde Reparatur und assoziierten Entzündungsreaktion mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung mit lebenden visualisieren Drosophila Puppen. Wir bieten eine detaillierte Methode um die Schritte für die Vorbereitung der ersten Puppen (Dissektion und Montage) und die anschließenden Laser-vermittelten Verwundung und Zeitraffer Imaging zu decken. Wir beschreiben auch die Verwendung von Foto-Cabrio Fluorophore ermöglicht die Kennzeichnung von bestimmten Immunzellen Teilmengen in Vivo. Auf lange Sicht stellen wir uns, dass dieses neue Drosophila pupal Modell sezieren die komplexe Signaltechnik Dynamik zugrunde liegt die entzündliche Reaktion auf Gewebeschäden spannende Möglichkeiten eröffnet. Durch die Anwendung komplexer statistischer Analysen könnte man Funktionen der Antwort aufdecken, die sonst experimentell unzugänglich blieben, während die verbesserte Effizienz der RNAi sich für die Anwendung der genomweiten Screening innerhalb eignet könnte Immunzellen in Vivo zu identifizieren, neue Spieler Immunzelle Verhalten regulieren.

Protocol

Dieses Protokoll besteht aus vier wesentlichen aufeinander folgenden Schritten: (1) Vorbereitung der Drosophila -Aktien und Inszenierung von Drosophila Puppen, (2) Pupal Dissektion und Montage, (3) Pupal Verwundung, (4) in Vivo Time-Lapse confocal Imaging. 1. Vorbereitung des Drosophila -Bestände und Inszenierung der Puppen Erhalten Sie entsprechende Drosophila -Aktien (siehe Einführung und Table of Materials). Sammeln Sie jungen gesunde Erwachsene fliegen von der entsprechenden Genotyp. Wählen Sie Erwachsener fliegt mit Kohlendioxid-Gas-Pads um die fliegen kurz betäuben und ein feiner Pinsel übertragen fliegt der entsprechenden Genotyp oder Geschlecht zu einem Sammelbehälter. Jedes Fläschchen mit standard fliegen Essen Medien 20 jungfräulichen Frauen und 20 Männer hinzufügen (eine Mischung von Maismehl-Melasse-Agar, siehe Tabelle der Materialien) ergänzt mit Hefe. Für die optimale pupal Generation Tipp der Erwachsenen Flies jeden Tag auf neue Nahrung in frisches Fläschchen halten alle Fläschchen bei 25 ° C.Hinweis: Wenn die Gal4-UAS-System31 Abstammung-spezifische Genexpression fahren verwendet wird, sollten alle Schritte bei 25 ° C oder höher, ausgeführt werden wie das Gal4-UAS-System temperaturempfindlich ist. 18 Stunden vor der geplanten bildgebenden Sitzung wählen Sie mindestens 10 neu gebildete weißen Pre-Puppen (Abbildung 1A) aus dem Fläschchen (d.h. 0 h nach puppenkammer Bildung, APF) mit Zange oder einen feinen Pinsel, um Puppen von der Oberfläche der inneren Fläschchen zu verdrängen und übertragen Sie Puppen vorsichtig auf die Seite eines leeren Kunststoff Vials.Hinweis: Wandernde 3rd Instar Larven kriechen nach oben aus der Nahrung zur Verpuppung zu unterziehen; neu gebildeten weißen Prepupae sind leicht erkennbar, da sie aufschwingenden anterior Luftlöcher besitzen und sind stationär (im Gegensatz zu 3rd Instar Larven). Die Nagelhaut verwandelt sich in die “puppenkammer” (der pupal Fall) ist zunächst weich und weiß17. Vorsicht ist zur Vermeidung von Schäden die Puppen, da dies nicht nur eine ungewollte Verletzung-induzierten Entzündungsreaktion, sondern auch eine erhebliche Entwicklungsverzögerung führen kann. Alter der ausgewählten Puppen auf der entsprechenden Entwicklungsstufe (18 h optimale Ergebnisse gebe APF) in das Fläschchen bei 25 ° C.Hinweis: Bei der Entwicklung der Puppen der pupal Fall zunehmend dunkler und spröder werden. Bereiten Sie anderen Reagenzien für den nächsten Schritt vor der Zeit. Machen die Heptan kleben, kombinieren Sie eine 20 cm Länge der aufgerollten doppelseitiges Klebeband mit 20 mL Heptan in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen, seal mit Paraffin Film und Rock bei Raumtemperatur über Nacht auf der Bank. 2. Vorbereitung und sezieren von Drosophila -Puppen Übertragen Sie die inszenierten Drosophila -Puppen auf ein Stück doppelseitiges Klebeband montiert auf einem Objektträger. Positionieren Sie die Puppen so, dass der Bauchseite auf das Band fest ist und die dorsale Seite nach oben zeigt (Abb. 1 b).Hinweis: Die vorderen Puppe wird von den zwei Luftlöcher ragen aus der vorderen Ende der pupal Fall erkennbar. Entfernen Sie vorsichtig die Puppen aus ihrer schützenden puppenkammer Gehäuse unter dem Hellfeld Dissektion Mikroskop mit Zange und Mikro-Schere (Abbildung 1 b-D). Machen Sie einen Einschnitt zunächst im Großraum anterior-die meisten von der puppenkammer mit der Pinzette (Abbildung 1 b). Sicherstellen Sie, dass in diesem Bereich die pupal Fall ist hohl und frei von pupal Gewebe, weil die Puppen innerhalb der Fall während der frühen Entwicklung pupal geschrumpft werden. Nach dieser ersten Einschnitt sorgfältig reißen Sie oder schneiden Sie den pupal Fall in einer vorderen zum hinteren Richtung mit Zange oder Microscissors (Abbildung 1), bis die Puppe völlig frei von Braun opak spröde Gehäuse (Abbildung 1 ist auf).Hinweis: Puppen in diesem Stadium sind sehr empfindlich und muss darauf geachtet werden, um zu vermeiden, punktieren die pupal Oberfläche; Punktion ist offensichtlich, wie Hämolymphe schnell aus der Einstichstelle Austritt. Puppen mit Punktionen, egal wie klein, müssen entsorgt werden. Montieren Sie die Puppen in einem Glasboden-Teller mit Heptan-Klebstoff. Verwenden Sie eine 20 mL-PIPETTENSPITZE um eine 10 mL Tropfen vorbereiteten Heptan Klebstoff (siehe Abschnitt 1.6 oben) in einer Linie auf dem Glasboden-Teller platzieren. Lassen Sie den Kleber Trocknen 5 s vor der Übertragung der sezierten Puppen vorsichtig auf den Heptan Kleber mit Pinzette (Abbildung 1E). Zur Erleichterung der Verwundung und Bildgebung die Puppen Line-up in Folge; ca. 5 Puppen werden vorgeschlagen, aber mehr wird überschaubar mit Erfahrung.Hinweis: Verwendung von Heptan Leim wird empfohlen, beim Einsatz von aufrechter bildgebender Systems aber ist nicht notwendig, wenn ein umgekehrte System verwenden. Wenn der Leim optische schafft Aberrationen während der Bildgebung, Puppen können direkt auf das Deckglas stattdessen platziert werden – die natürliche Adhäsion zwischen dem pupal Gewebe und Glas werden für stabile Bildgebung, in den meisten Fällen ausreichend, solange dafür gesorgt wird, wenn die Bildgebung zu bewegen Gericht zwischen Mikroskope. Montieren Sie um beste Ergebnisse zu erzielen die Puppen, so dass der Flügel in direktem Kontakt mit dem Deckglas (Abb. 1F) flach auf das Deckglas mit der Mehrheit der Flügeloberfläche ist. Rollen Sie die Puppen mit Pinzette, ändern ihre Position, um sicherzustellen, dass der Flügel richtig montiert ist. Um Beispiel Dehydrierung während der Bildgebung Periode zu verhindern, fügen Sie ein Stück saugfähigem Filterpapier in destilliertem Wasser auf der Seite der Glasboden Schale am Ende der Montage darauf achten, nicht zu stören die Puppen (Abbildung 1E) getränkt. Bedecken Sie die Schüssel mit einem Deckel.Hinweis: Puppen sind jetzt bereit für verletzte und Bildgebung. (3) Laser-induced Verwundung von Drosophila Pupal Flügel Übertragen Sie die Glasboden-Schale mit der montierten Puppen zu einem Weitfeld-Mikroskop mit einem abstimmbaren Laser Ablation System ausgestattet. Verwendung ein gepulster UV luftgekühlten Stickstoff-gepumpte Ablation Laser auf 435 abgestimmt nm – siehe Tabelle der Materialien für Details11; die genaue Wellenlänge des Lichts verwendet für die Beleuchtung wird durch den Benutzer über einen entsprechenden Farbstoff-Zelle ausgewählt. Mit Hellfeld Optik, passen Sie die Mikroskop Bühne Steuerelemente den pupal Flügel die erste Puppe zu finden (Abb. 1F) verwundet. Verwenden Sie für ein optimales Ergebnis eine Öl eintauchen 40 X oder 63 X Objektiv für beide die Bildgebung und laser-Ablation; sicherzustellen Sie, dass die Flüssigkeit eintauchen verwendet (Öl oder Glycerin) zwischen Ablation und imaging-Systemen entspricht. Passen Sie das Mikroskop zu konzentrieren sich auf der Ebene der pupal Flügel Epithel nächste Glas Deckglas (d. h. Fokus auf die Region des Epithels, verwundet zu werden) über den Feinfokus Regler. Mit dem Mikroskop Stadium Anpassungen, die pupal Flügel so positionieren Sie, dass das Gebiet um verwundet zu werden direkt mit den bekannten Zielbereich der Laser Ablation ausgerichtet ist. Verwenden Sie eine Energiedichte Dämpfungsglied Folie ausgestattet, um das Mikroskop, um manuell die Leistungsstufe des Lichts Ablation anzupassen.Hinweis: Der Abschwächer-Regler hat Raststufen und Urteile zu identifizieren die relative Höhe der Dämpfung und erlauben den Einsatz von reproduzierbare Einstellungen. Verwenden eine externe manuelle Trigger -Steuerung, aktivieren Sie die Ablation-Laser mit einem kurzen Klick des Auslösers, um eine Wunde zu machen. Überprüfen Sie für das Erscheinungsbild der transienten Luftblase am Standort Ablation da verletzte Regel begleitet wird es. Überprüfen Sie, ob die Laserinduzierte Verwundung wurde erfolgreich mit den entsprechenden fluoreszierenden filtern das pupal Epithel zu visualisieren.Hinweis: darauf achten Sie, um zu versehentlichen Exposition gegenüber Laserstrahlen zu vermeiden, da der Strahl Reflexionen schwere Auge verursachen oder Hautschäden. Verwundung nicht erfolgreich ist, variieren Sie die Brennebene (Verschieben des Mikroskop-Fokus etwas oberhalb oder unterhalb der aktuellen fokalen Ebene) und wiederholen Sie den Klick des Triggers Ablation. Alternativ, erhöhen Sie die Leistung des Lasers mit dem Dämpfungsglied Schieber, bis die gewünschte Wunde Größe erreicht ist. Um die Ablation Laser Pulswiederholrate unterschiedlich sind, verwenden die Wiederholrate Knopf auf dem hinteren Bedienfeld (die ändert sich der Rate von weniger als 1 Impuls/s bis zu 60 Hz). Setzen Sie für optimale Verwundung die Pulswiederholrate bis 40 Hz. Um verschiedene große Wunden erzeugen, anhand der Energiedichte Dämpfungsglied Folie die Leistungsstufe des Lichts Ablation manuell anpassen. Verwundung aller montierten Puppen zu unterlassen und diese Puppen nicht abgetragen als unverletzten Steuerelemente verwenden. Konsistente Ergebnisse regelmäßig neu ausrichten der Ablation System (mit der entsprechenden Betriebsanleitung). Außerdem reinigen Sie und füllen Sie die Farbstoff-Resonator-Zelle, die die Wellenlänge des Lasers Ausgabe steuert. 4. in Vivo Time-Lapse Confocal Imaging Schnelle Übertragung von Glasboden Schale zu einem geeigneten Mikroskop für Zeitraffer-Aufnahmen.Hinweis: Für ein optimales Ergebnis verwenden Sie eine hohe Spezifikation konfokale oder drehende Scheibe Mikroskop ausgestattet mit empfindlichen Detektoren, die GFP und mCherry Fluorophore erkennen kann. Um die gesamte pupal Flügel Bild, verwenden Sie eine geringe Vergrößerung (z.B. 20 X)-Objektiv (Abbildung 2A). Um Bild Wunde Reparatur und die begleitende Entzündungsreaktion mit hoher räumlicher Auflösung, verwenden die Ölimmersion 40 X (NA 1.3) oder 63 X (NA 1.4) Objektive (siehe repräsentative Bilder in Figur 2 b-D). Öffnen Sie die entsprechende Bild-Capture-Software mit dem Mikroskop verbunden. Mit der Bild-Capture-Software, schalten Sie die geeigneten Laser z.B. die 488 nm und 561 nm Laser GFP und mCherry Fluorophore, bzw. (durch Klicken in die entsprechenden Felder) zu visualisieren und Anpassen der Laserleistung und Gain/Offset Einstellungen geben ausreichende Fluoreszenzsignal wobei Pixel Sättigung zu vermeiden; Verwenden Sie die niedrigste mögliche Laserleistung (im Bereich von 5-20 %), Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren. Um die Reparatur zu erfassen Epithel und entzündlichen Zelle Rekrutierung, setzen das Mikroskop aufzunehmen einen Z-Stapel mit den Einstellknöpfen Feinfokus auf dem Bedienfeld; um optimale Ergebnisse zu erzielen soll die Software (mit manueller Mausklicks) Rekord Z-Scheiben durch den pupal Flügel (mindestens alle 3 mm), von der Spitze des Verwundeten Epithel durch zu den extrazellulären Raum unter (mit Migration von Hemocytes), ein großes zu erreichen Z-Stapel (in der Größenordnung von 50-100 mm). Für Zeitraffer-Aufnahmen aufzeichnen Z-Stacks in regelmäßigen Abständen (mindestens alle 30 s) für mindestens 1 h nach Verwundung.Hinweis: Der genaue zeitliche Abstand zwischen Z-Stapel ausgewählt stellt einen Kompromiss zwischen Erfassung der sich rasch wandelnden Zelldynamik und Foto-Bleichen der Proben zu vermeiden. Um gleichzeitig mehrere Puppen (einschließlich unverletzten Kontrollen nicht abgetragen) Bild, verwenden Sie einem motorisierten Stadium (verbunden mit dem Mikroskop) und die Multi-Positionserfassung-Funktion innerhalb der imaging-Software. Die Position jedes einzelnen Puppe innerhalb der Software über die Bühne-Position Regler manuell einstellen und dann manuell Grenzwerte der entsprechenden Z-Stapel (oben und unten) für jede einzelne Puppe. Visualisieren Sie die Time-lapse Bilder während der Aufnahme oder später mit Spezialist Bildanalyse-Software (z. B. ImageJ32) mit Z-Stapel-Projektionen oder 3-d-Rendering. Beispielsweise, um die Bewegungen der einzelnen Hemocytes folgen (wie in Abbildung 2′ und D’), Track Hemocyte Kerne mit frei zugänglichen ImageJ-Plug-ins “TrackMate” oder “Handbuch Trackingmethoden” (veröffentlicht in 33, ( 34). Verwenden Sie Photoconvertible Sonden (z. B. Kaede30) selektiv Photoconvert und beschriften Sie eine Teilmenge der epithelialen oder immun Zellen während der Bildgebung. Entsprechenden Modulen innerhalb der imaging-Software den Ladungszustand durchführen (z. B. FRAP, Fluoreszenz-Erholung nach dem Foto bleichen Modul) und aktivieren Sie die 405nm Laser (durch Klicken im Feld entsprechende Software)35. Markieren Sie Zellen zu Photoconverted innerhalb der FRAP-Software mit der quadratische, Runde oder Freihand-Auswahl-Werkzeug. Innerhalb der FRAP-Software legen Sie den Zeitverlauf für Ladungszustand (bleichen) zu einem einzigen Iteration/Frame und 405 nm-Laser bei 20 % Laserleistung. Manuell Starten Sie das Experiment , Ladungszustand ausführen klicken. Beenden der FRAP-Modul (Klicken Sie auf Schließen) und zurück zur ursprünglichen imaging innerhalb der Software; Verwendung der 488 nm und 561 nm Laser auf das Verhalten von Photoconverted und nicht Photoconverted Zellen Bild durch Einrichtung eines Z-Stapel und zeitrafferaufnahme wie oben beschrieben.Hinweis: Photoconverted Sonden bleiben stabil für viele Stunden nach der ersten Ladungszustand, wodurch das Verhalten der Photoconverted Zellen im Laufe der Zeit (für mindestens 5 h) einzuhalten. Z. B. können Entzündungszellen in der Wunde selektiv Photoconverted (Abb. 2F) und ihr Verhalten gefolgt von Verletzung Aufstellungsort (Abbildung 2 und H) verrechnet.

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Drosophila -Puppen für live Zeitraffer Aufnahmen von Wunde Reparatur und Entzündungen in Vivo. Mit dieser Methode sollte es möglich, mehrere hochauflösende Filme von pupal Wundverschluss und entzündlichen Zelle Rekrutierung mit Leichtigkeit zu erzeugen und die Puppen für längere Zeit (mindestens 5 h) Post-ohne signifikante Immunofluoreszenz Verwundung Bild. Ein allgemeines Schema für Drosophila Puppe Vorbereitung Abbildung 1 zeigt die optimale Methode für die Zubereitung von Drosophila -Puppen für die in-Vivo Bildgebung. Drosophila , die weißen “Prepupae” auf “0 h” nach puppenkammer Bildung (APF), gesammelt werden, wie die kriechenden Larven nicht Beweglichkeit mehr und nehmen die stereotype pupal Form mit umgestülpt Atmung Anhängsel (Atemlöcher) sichtbar an ihrem vorderen-die meisten Ende ( Abbildung 1A). Weiß 0 h APF Prepupae dürfen für 18 h bei 25 ° C zu entwickeln, in welcher Zeit die puppenkammer geworden Brown (Abbildung 1 b) und sind dann mit feinen Zangen und/oder Microscissors (Abbildung 1 seziert, die pupal Schutzhülle entfernen) zeigen die optisch transparent Puppe innerhalb (Abbildung 1). Nach Dissektion werden die pupal Flügel auf die Seitenflächen des pupal Thorax (beschrieben in blau, Abbildung 1-D) sichtbar sein. In dieser Phase sind andere pupal Körperteile auch leicht erkennbar, einschließlich der Augen, Beine und Bauch (mit der Aufschrift in Abbildung 1). Die Beine sind auch geeignet für Wunde Entzündung Studien und können mit der gleichen Lasermethode, die oben beschriebenen verwundet werden. Mehrere 18 h APF Puppen gleichzeitig innerhalb der bildgebenden Schale (Abbildung 1E, Heptan Kleber mit Wasser getränkten Filterpapier Dehydrierung zu minimieren) mit flachsten Teil des Flügels (skizzierten blau) in Kontakt mit dem Deckglas ( montierbar Abbildung 1F); Dies ist besonders vorteilhaft, wenn das Image Mikroskop mit einer motorisierten Bühne ausgestattet ist, ermöglicht mehrere Puppen während einer einzigen bildgebenden Periode erfasst werden. Alle Puppen, die während der Dissektion oder Montage beschädigt wurden weggeworfen werden sollten (z.B. die Puppe Drittel befindet sich in der Sequenz, Pfeil in Abbildung 1E). Andere Körperteile (z.B. Augen und Beine, skizzierte rosa) können auch Kontakt mit dem Deckglas und stehen zum verwunden und anschließende imaging (Abbildung 1F). Für Experimente, die einzige Wunden zu studieren sind Laser-induzierte Schäden in der Regel am besten zentral im Flügel (Sternchen, Abb. 1F), zugefügt obwohl anderen Orten verwendet werden können, wenn mehrere Wunden untersucht werden sollen. Sterile Verwundung aktiviert eine starke entzündliche Reaktion im Drosophila pupal Flügel Um Wunde Reparatur und die begleitende Entzündungsreaktion in-vivo, folgen die Verwundeten Flügel von 18 h-APF Drosophila -Puppen wurden abgebildet mit konfokale Zeitraffer-Mikroskopie (Abbildung 2A-H). In diesem pupal Stadium sind die Flügel Epithelien einfachen flachen Platten aus Zellen (mit der Bezeichnung hier mit GFP-Tags E-Cadherin zu einzelnen Zellgrenzen, mark Flügel Marge gemäß Abbildung 2A). Auch im unverletzten Flügel (niedrige Vergrößerung, Figuren 2A und 2A “), große Anzahl von wandernden angeborenen immunen Zellen (Hemocytes, beschriftet mit Srp-Gal4 zytoplasmatischen GLP, grüne, getrieben und nukleare RFP, Magenta) befinden sich innerhalb der Hämolymphe ( Insekt Blut) besetzen die dazwischen liegenden Extrazellulärraum (Abb. 2A und 2A’). Laser-induzierte Schädigung der pupal Flügel Epithel (Wundrand skizziert in weiß, Abbildung 2 b-D) fördert eine schnelle Migration von Hemocytes an der Wundstelle (Abb. 2 b-D und immun Zellkerne in Abbildung 2 b ‘-D’). Kennzeichnung der Hemocytes mit den beiden ein nuklearen Marker (z. B. die nukleare RFP “rot-Stachel”) in Kombination mit einem zytoplasmatischen oder Zellskelett Marker (z.B. zytoplasmatischen GFP oder GLP-Tags Moesin) ist besonders vorteilhaft, da dadurch die gleichzeitigen Verfolgung von Hemocyte Kernen (für die automatisierte Analyse von Hemocyte Verhalten z.B. Migration Geschwindigkeit und Richtung) und die Visualisierung der Hemocyte Morphologie. Letzteres ist wichtig, denn es ermöglicht uns, festzustellen, ob Hemocytes nekrotische Schutt phagocytosing sind (Abbildung 2, inset) am Rand der Wunde (oder Mikroben im Falle einer Infektion)12,23 und erlaubt uns auch, folgen Ihr hervorstehende Verhalten wie sie feine Filopodien oder Lamellipodia an ihre Spitze zu erweitern, wie sie in Richtung oder Weg von der Wunde zu migrieren. Einfache Verfolgung von Hemocyte nuklearen Flugbahnen mit entsprechenden Bildanalyse Software32 (Table of Materials) zeigt die komplexe räumlich-zeitliche Dynamik der Entzündungsreaktion, ähnlich wie zuvor berichtet, für Embryonen9,36 verwundet (mehrfarbige Spuren, Abbildung 2′ und D’). Innerhalb von nur 30 min von Verwundung, beginnen Hemocytes befindet sich am nächsten zur Verletzung Aufstellungsort gerichtete Migration in Richtung der Wunde (Abbildung 2″). Jedoch mit zunehmender Zeit nach der Verletzung, Hemocytes befindet sich nach und nach weiter Weg von der Verletzung Aufstellungsort auch beginnen gerichtete Migration in Richtung der Wunde (Abb. 2D”). Auf diese Weise ist eine “Welle” der Immunzelle Reaktionsfähigkeit, die nach außen erstreckt sich von der Wunde Kante beobachtet, die wir uns vorstellen, um die Diffusion von der Wunde lockstoffgradient Weg von Verletzung Aufstellungsort zu reflektieren. Diese räumlich-zeitliche Immunzelle Dynamik einen nützlichen Ausgangspunkt für unsere aktuelle Studie, die anspruchsvolle mathematische Modellierung (“Bayesian Inference”) Analyse, neuartige Eigenschaften des Wunde Lockstoff Signals (detaillierte Methoden abzuleiten eingesetzt zur Verfügung gestellt veröffentlicht in23). Durch Kalibrierung unserer Rechenmodelle (das die Wunde Lockstoff Steigung zur Hemocyte Vorspannung verbunden) um die beobachteten in Vivo immun Flugbahnen zu passen, könnte eine detaillierte Eigenschaften der Wunde Lockstoff aus unserer Hemocyte Flugbahn extrahieren. Daten (z. B. die Diffusionsgeschwindigkeit Signal, die Quelle und die Dauer des Signals Produktion)23. Darüber hinaus mit einer Fahrt Ausdruck der Photoconvertible Fluorophor Kaede innerhalb der Immunzelle Linie mit Srp-Gal4 (grün, Abbildung 2E) wir auch gezielt eine Subpopulation von diese wandernden Flügel Hemocytes (z. B. beschriften konnten diejenigen, die an der Wundstelle rekrutiert; E, vor UV-induzierten Ladungszustand und F, Post-Ladungszustand). Wir können dann das Verhalten dieser Hemocytes im Laufe der Zeit (Magenta, Abbildung 2-H) folgen, wie sie weg von der Wundstelle (Pfeile, Abbildung 2 und H) lösen und vergleichen, wie ihr Verhalten ist anders als die nicht-photoconverted Zellen, die Verletzung Aufstellungsort nicht erreichen. Wir haben dieses in-Vivo -labeling Technik verwendet, um zu zeigen, dass Hemocytes rekrutiert auf ein erstes Wunde vorübergehend auf eine zweite Wunde erzeugt desensibilisiert sind 90 Minuten später23, obwohl diese differenzierte Kennzeichnung Technik könnte auch haben Sie viele andere aufschlussreichen Anwendungen in der Zukunft (siehe Diskussion). Mithilfe dieses Ansatzes können wir gleichzeitig auch die räumlich-zeitliche Dynamik der Wunde Reparatur oder bist Epithelisierung folgen “(Abb. 2 b-D). Hier ubiquitär ausgedrückt GFP-Tags E-Cadherin Etiketten die zelluläre Adherens Junctions im gesamten Flügel Epithel und ermöglicht die Formen der einzelnen Epithelzellen im Laufe der Zeit folgen werden. Die Wunde Rand ist leicht zu erkennen wie die Kreuzung zwischen intakten GFP-markierten Epithelzellen und unbeschriftete Schutt (weiße gestrichelte Linie, Abb. 2 b-D). Für die Mehrheit der Wunden beginnt die Wunde zu innerhalb 1 h nach Verletzungen und die Wunde Kante Fortschritte nach innen (Abb. 2D); Re epithelisiert dieser Größe wird in der Regel innerhalb von 2-3 h von Verletzungen23Wunden. Wundverschluss in Embryonen und Puppen treibt ein Actomyosin kontraktilen Kabel zusammen mit Vorderkante Aktin-reiche Filopodien23,37; Diese Zellskelett Dynamik können direkt während der Wunde Reparatur unter Verwendung geeignete in-Vivo -Reporter, wie GFP-Tags Spaghetti-Kürbis (Myosin regulatorische leichte Kette) oder GLP-Tags Aktin-bindende Moesin23visualisiert werden. Für einige besonders großen Wunden jedoch die Actomyosin Kabel und Vorderkante Filopodien nicht beibehalten – diese Wunden “chronisch” und nie vollständig neu epithelisiert23 auch nach viel längere Zeiträume (mehr als 24 Stunden) in vivo Imaging. Interessanterweise ist die entzündliche Reaktion, die verbunden sind mit diesen nicht-heilende Wunden deutlich anders aus, die verbunden sind mit normalen akuten Wunden23 darauf hindeutet, dass abnorme Immunzelle Verhalten eine nützliche prognostische Marker in der Klinik sein könnte . In Zukunft könnten weitere in Vivo Analyse der chronischen Wunden mit langfristigen Bildgebung (über 24 h) im pupal Modell wichtige mechanistische dieser schwächenden Krankheit Einblick in. Abbildung 1: Drosophila Puppe Vorbereitung für verletzte und live-Imaging. (A) Drosophila weißen Prepupae um 0 Uhr APF, mit vorderen Ende gesammelt durch umgestülpt Atmung Anhängsel (Atemlöcher) angegeben. (B) nach der Erhöhung der weißen 0 h APF Prepupae 18 h bei 25 ° C, erscheint der puppenkammer braun. Dissektion der pupal Fall sollten beginnen, um der anterior-die meisten Region (Pfeil), durch die ausladenden Atemlöcher angegeben, wie die richtige Puppe fehlt aus dieser Region, und feine Pinzette und/oder Microscissors verwendet, um die pupal Schutzhülle (C) entfernen. Die pupal Flügel werden auf die Seitenflächen des pupal Thorax (blaue Linien). (D) Pupal Fall komplett aus 18 h APF Puppe entfernt, hier die Puppe hat gerollt worden 90° um zu zeigen, lateralen Seite, mit dem Flügel abgebildet werden blau hervorgehoben. (E-F) Fünf 18h APF Puppen montiert auf Glas Deckglas im imaging-Gericht mit Heptan Kleber mit Wasser getränkten Filterpapier, Austrocknung (E) zu minimieren. Puppe befindet sich dritte in der Sequenz (Pfeil) sollte weggeworfen werden, da während der Zubereitung Schäden. Puppen sind mit dem flachsten Teil des Flügels (skizzierten blau) in Kontakt mit dem Deckglas (F) montiert und Laserinduzierte Wunden entstehen zentral im Flügel (Sternchen, F), obwohl andere Standorte verwendet werden, können wenn mehrere Wunden sind untersucht werden. Das Bild (D) adaptiert mit Erlaubnis von Weber Et Al., 201623. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Dynamische in Vivo Analyse der entzündlichen Reaktion auf Gewebeschäden. Puppen von pupal Schutzhüllen seziert und auf Glas Deckglas (A) montiert sind verwundet und anschließend abgebildet mit konfokale Zeitraffer-Mikroskopie (B-H). Niedrige Vergrößerung Blick auf der unverletzten pupal Flügel (A, Flügel Marge in weiß dargestellt), die enthält eine große Anzahl von Zugvögeln Hemocytes (A’). Laser-induzierte Schädigung pupal Flügel Epithel (B-D, Zellgrenzen mit der Bezeichnung verwenden GFP-Tags Drosophila E-Cadherin; Wunde Rand weiß konturierten) aktiviert eine schnelle Entzündungsreaktion bei der Migration von mehreren Hemocytes ( SRP-Gal4 getrieben Ausdruck der nuklearen RFP, Magenta und zytoplasmatischen GFP, grün) in Richtung der Wundstelle (B-D, repräsentativen Rahmen aus einem Zeitraffer-Film, in dem jedes Bild eine Projektion von 25 Scheiben 3 μm ist). Manuelle Verfolgung der Hemocyte Bahnen (mehrfarbige Spuren, C’ und D’) zeigen die komplexe räumlich-zeitliche Dynamik der Entzündungsreaktion, ähnlich, die für verwundete Embryonen berichtet. Hemocytes phagozytieren auch nekrotische zelltrümmer an der Wundstelle (Pfeilspitze, C und auch eingelassen). Ausdruck von Photoconvertible Fluorophor Kaede in der Immunzelle Linie (grün, E, mit Srp-Gal4) ermöglicht die Wunde rekrutiert Hemocytes (Pfeil, E), differentiell beschriftet (Magenta, F) und befolgt werden im Laufe der Zeit aus Verletzung Aufstellungsort (Pfeile, G und H) verrechnet. Die folgenden pupal Genotypen wurden eingesetzt: (A-D) w1118; Ubi-DE-Cad-GFP, Srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) undE-H w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Bilder adaptiert mit Erlaubnis von Weber Et Al., 201623. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Die Akute entzündliche Reaktion auf Gewebeschäden ist ein komplexer und sehr dynamischen Prozess, der unerlässlich ist, die Reparatur von verletzten Geweben, einschließlich die Clearance von nekrotischen Schutt und der Kampf gegen die Infektion zu orchestrieren. Um vollständig zu verstehen und grundlegende Aspekte dieser Reaktion zu entwirren, ist es entscheidend, dass Studien durchgeführten in-Vivo auf 3-dimensionale lebenden Proben in Reihenfolge für das genaue Verhalten und Interaktionen der verschiedenen-Linien beteiligt Zell zu beachten genau im Laufe der Zeit. Echtzeit-Analyse von diesen Zelldynamik ermöglicht eine genauere Charakterisierung der mutierten Phänotypen als statische einzelnen Zeitpunkten von örtlich festgelegten Proben mit klassischen Immunohistochemistry Techniken. Bisher wurden die meisten live-Imaging-Studien mit dem genetisch gefügig Drosophila -Modell die embryonale Phase der Fruchtfliege Entwicklung aufgrund seiner optischen Transluzenz und Unbeweglichkeit im Vergleich zu den späteren Entwicklungsstadien⁴ verwendet. ^, ⁵. jedoch vor kurzem unserer Gruppe und andere entwickelten Drosophila -Puppe als neuartige Modell, hoher Auflösung und langfristige Bildgebung des Wunde Reparatur und Entzündung gleichzeitig durchzuführen in Vivo⁸^,²² ^,²³. Dieser neue Ansatz bietet ein spannende langfristiges Potenzial für entwirren grundlegende Aspekte des Verhaltens entzündliche Zelle und kann weiter angepasst werden, um das dynamische Verhalten der anderen Zelle Linien (z. B. Drosophila Adipozyten untersuchen ³⁸) nach Gewebeschädigung.

Es gibt eine Reihe von kritischen Faktoren bei der Vorbereitung und Darstellung der Verwundeten Drosophila -Puppen, die die Qualität der oben beschriebenen bildgebenden Ergebnisse feststellen. Wohl ist der schwierigste Schritt beschriebene Protokoll die sorgfältige Präparation und präzise Positionierung der Puppen vor Verwundung und Bildgebung. Puppen in dieser Entwicklungsphase sind extrem empfindlich und auch kleine Unfallschäden an die Puppen während zubereitungsschritten wird das Experiment erheblich beeinträchtigen; alle Puppen, die unbeabsichtigte Schäden erlitten haben können müssen aus dem Experiment verworfen werden, da diese Schäden eine eigene Entzündungsreaktion aktivieren konnte führen könnte zu mehr weit verbreitet (oder auch systemische) Effekte auf entzündliche Zelle Verhalten an anderer Stelle in die Puppe. Aufgrund der Weiterentwicklung der Puppen, die in diesen Experimenten (die bedeutende Gewebe Umgestaltungen um Gewebe für Erwachsensein vorzubereiten durchmachen), verwendet gelegentlich Puppen bewegt sich im Laufe der Bildgebung. Pupal Rollen ist, aber, wahrscheinlicher, wenn die Puppen nicht korrekt mit der flachsten Oberfläche des Flügels (oder anderes Gewebe zu abgebildet werden) im direkten Kontakt mit dem Deckglas; montiert wurden Verwendung von Heptan Leim, die Puppen auf dem Deckglas zu stabilisieren sollte diese unerwünschte Bewegung minimieren. Aus diesem Grund muss auch sehr darauf geachtet werden, um zu vermeiden, verdrängen die Puppen aus ihren sorgfältig ausgerichteten Positionen beim Wechsel der Proben zwischen Mikroskope; im Idealfall wird der Verwundung Laser zum gleichen Mikroskop für nachfolgende Zeitraffer Bildgebung und Foto-Konvertierung zu verwendende beizufügen.

Neben die Ausprägung der pupal Dissektion und Montageschritte wird die exakte Genotyp der Drosophila -Puppen verwendet erhebliche Auswirkungen auf die Qualität der Bilddaten erzeugt haben. Die Anzahl der Kopien des Gal4 -Treiber und UAS-Konstrukte (z.B. FH-GFP oder UAS-Kaede) innerhalb einer einzelnen pupal Genotyp bestimmen beispielsweise, das Signal-Rausch-Verhältnis während der nachfolgenden Bildgebung. Als Faustregel desto mehr Kopien eines Gal4 oder UAS konstruieren Gegenwart, desto größer die Gesamthöhe des fluoreszierenden Proteins (z. B. GFP oder Kaede) innerhalb des Gewebes. Das optimale Niveau der fluoreszierenden Proteins werden jedoch eine sorgfältige Balance zwischen erhebend Gewebe Fluoreszenz genug, um qualitativ hochwertige Bildgebung (Aktivieren der Verwendung von niedrigeren Laserleistungen, Reduzierung der Immunofluoreszenz und imaging über längeren Zeitraum Perioden) aber ohne Fluorophor-induzierte zelluläre Toxizität; die optimale Anzahl von Gal4 und UAS Konstrukte in jedem Experiment variiert je nach der bestimmten Treiber und Fluorophore verwendet wird. Vorsicht, die Puppen bei 25 ° C (oder höher, bis zu 29 ° C) zu erhöhen, weil das Gal4-UAS-System temperaturempfindlich ist und bei niedrigeren Temperaturen³¹unwirksam werden. Um zusätzliche Ebenen der Kontrolle über das Gewebe oder Zeit-Spezifität des Gal4 –getrieben Ausdruck zu erreichen, kann die Gal4-UAS-System-Repressor Gal80 auch in die pupal Genotyp³⁹aufgenommen werden. Gal80 kann entweder zur Gal4-Aktivität in einem bestimmten Gewebe (mit einem gewebespezifischen Gal80) oder zu einem bestimmten Zeitpunkt zu unterdrücken (mit einer Temperatur empfindliche Gal80). Das Gal4-UAS-System weiter mit anderen unabhängigen binären Systemen (z. B. die LexA –LexAop und QF –QUAS Systeme) kombinierbar um Drosophila zu erzeugen, die mehrere Konstrukte (z.B. Fluorophore, RNAi Zeilen hat oder anderen genetischen Konstrukte) gleichzeitig in einer Reihe von verschiedenen Geweben³⁹ausgedrückt.

Verwendung dieses neuen Drosophila pupal Modells bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber dem traditionellen Embryo-Ansatz. Im Vergleich zu den kurzfristigen Bildgebung (max. 3 h) erhältlich in 15 Embryonen (die Bühne an dem meisten embryonalen Verwundung Studien werden durchgeführt), Puppen können über wesentlich längere Zeiträume (im Prinzip erst im Erwachsenenalter nach 96 h pupal Entwicklung abgebildet werden ). Darüber hinaus weit größere Zahl von Hemocytes (Drosophila angeborenen immunen Zellen) sind vorhanden in den pupal Geweben (und für die Bildgebung) im Vergleich zu den begrenzteren innerhalb der Embryo vorhanden und Dies ermöglichte uns, sammeln deutlich mehr Bilddaten auf Hemocyte Verhalten unter Verwendung der gleichen Gesamtzahl der Proben. Entscheidend ist, hat dies wiederum ermöglicht gelten komplexeren mathematischen Modellierung um Hemocytes Verhalten zu analysieren und extrahieren Neuerungen der Wunde Lockstoffe und entzündliche Reaktion, die sonst experimentell geblieben wären unzugänglichen²³. Ein weiterer Vorteil des pupal Modells ist die RNAi vermittelte gen-Knockdown ist deutlich effizienter als um früher embryonalen Phase, so dass verbesserte Analyse des Gewebes oder Zeit-spezifischen gen-Inaktivierung mit binären Systemen wie dem Gal4-UAS-system ³⁹. die Effizienz der RNAi in diesem Stadium eröffnet somit das Potenzial, große Skala (oder sogar unvoreingenommene genomweite) durchführen RNAi-Bildschirme zur Suche nach neuartigen Akteure in Wunde Reparatur oder entzündliche Zelle Verhalten.

Jedoch Drosophila -Puppen klar können nicht verwendet werden, studieren die Phänotypen, die durch genetische Mutationen, die embryonale sind tödlich; funktionelle und live-Imaging Studien von Genen, die für die embryonale Entwicklung wesentlich sind müssen daher noch in Embryonen, durchgeführt werden, sofern RNAi vermittelte gen-Knockdown in einer Zeit oder gewebespezifische Weise Entwicklung ermöglicht durch pupal Stadien auftreten. Der Embryo bleibt auch das Modell der Wahl, um zu studieren und live-Bild bestimmte Funktionen von Immunzellen Verhalten, einschließlich die Entwicklungsstörungen Zerstreuung von Immunzellen von ihrem Ursprung, Kontakt-Hemmung der Fortbewegung und Phagozytose apoptotischer Leichen erzeugt bei Entwicklungsstörungen Gewebe Bildhauerei⁵^,⁸ , die noch nicht im pupal Modelle beobachtet wurden. Obwohl Studien bei Drosophila Larven und Erwachsenen einen wichtigen Einblick in die Mechanismen, die Wunde Reparatur und Entzündungen⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^, zur Verfügung gestellt haben ⁴⁴ live-Imaging-Studien in diesen Phasen haben schwierig, da die von Natur aus mobilen Charakter der Proben bewiesen. Während Larven betäubt werden können, ermöglichen kurze Perioden der Leben-Bildgebung kann aufgrund vorübergehender Art der Narkose, nur kurze Momentaufnahmen der live Wunde reparieren oder entzündliche Reaktion visualisierte⁴⁵. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat nun eine verbesserte Protokoll entwickelt, die längerfristige Bildgebung der Larven Wundheilung⁴⁶, erlaubt, obwohl Vorbereitung und imaging noch deutlich schwieriger bleiben als in Embryonen oder Puppen. Auf lange Sicht stellen wir uns, die durch die Nutzung der am besten geeigneten Entwicklungsphase um jede spezifische Frage, Studien in allen vier diese verschiedenen Phasen der Drosophila – von Embryonen durch Larven und pupal Perioden bis zum Erwachsenenalter (jeweils mit Ihre eigene einzigartige Vorteile und Grenzen) – geben ergänzende Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismus Wunde Reparatur und Entzündungen.

In Zukunft dieses Protokoll für verletzte und langfristige Imaging von Drosophila Puppen lässt sich leicht anpassen, eine Reihe von Entzündungen-bezogene Phänomene zu studieren und hat weitreichende Potenzial für Aufdeckung Neuerungen der entzündliche Wunde Antwort. Die Kombination von langfristigen Bildgebung sowie die Anwendung der Photoconvertible Fluorophore (z. B. Kaede), sind von großem Wert für das Verständnis der Dynamik der angeborenen Immunzelle Verhalten und vor allem die weit weniger verstanden Auflösung Phase des die Wunde entzündliche Reaktion. Durch speziell Beschriftung entweder einzelne oder Subpopulationen von Immunzellen (z. B. die rekrutierten auf eine Wunde) wird es möglich sein, analysieren, wie Exposition gegenüber einer ökologischen Cue (z. B. einer Leiche oder Verletzung) beeinflusst die Immunzelle nachfolgende Antwort zu einem späteren Zeitpunkt Cue. Entzündliche Verhalten von Drosophila Hemocytes durch frühere Erfahrungen geändert werden – zum Beispiel, sie sind grundiert Gewebeverletzung reagieren durch vorherige Phagozytose apoptotischer Leichen während der Entwicklung¹² aber es bleibt abzuwarten ob weitere ökologische Hinweise ähnliche Priming Ereignisse auslösen. Obwohl Studien pupal Wunden so weit auf die angeborene Entzündungsreaktion konzentriert haben, die pupal Flügel Modell bietet eine ideale Gelegenheit, sowohl live-Bild und sezieren die Mechanismen epithelialen Wunde Reparatur. Darüber hinaus könnte dieser pupal bildgebende Verfahren auch angepasst werden, um das dynamische Verhalten der anderen Zelle Linien als Reaktion auf Gewebe Schaden³⁸, entweder in die pupal Flügel selbst oder andere leicht zugängliche pupal Gewebe (z. B. die Augen, Beine oder Thorax) zu untersuchen. Schließlich konnte durch die Kombination der genetischen Lenkbarkeit von Drosophila zusammen mit der Leichtigkeit der langfristigen pupal Bildgebung, Roman epithelialen Reparatur oder entzündliche Aufsichtsbehörden aufgedeckt durch die Anwendung der unvoreingenommene genomweite Knock-Down-werden Ansätze.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten die Martin, Nobes, Richardson und Holz Übungseinheiten für hilfreiche Diskussion danken. Wir danken auch die Wolfson Bioimaging Anlage (University of Bristol, UK), Bloomington Lager Zentrum (Universität von Indiana, USA) und Vienna Drosophila Resource Centre (für Drosophila Bestände) und Flybase (für aktuell Drosophila gen Anmerkung). Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen MRC Projekt Zuschuss an Uhr und W.W (MR/J002577/1), ein Wellcome Trust Senior Fellowship, w. und ein Wellcome Trust Investigator Award bis Uhr.

Materials

*Drosophila* stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Kyoto Stock Center, DGRC	#109007	Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#58742	Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#59023	The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4;	Generated by Katja Bruckner	Generated by Katja Bruckner	Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#8545 or #8547	UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	Multiple stocks available (e.g. #1522)	Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#26161	Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#57145	The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFP^S65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ingredients for fly food media			Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
soya flour	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
malt extract	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
molasses	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
Difco agar	BD Biosciences, Fisher Scientific	DF0142-15-2	For preparation of fly food
Propionic acid	Sigma	402907	For preparation of fly food
Nipagen	Sigma	79721	For preparation of fly food
Dried baker's yeast	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	For preparation of fly food
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation and mounting
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush	Daler-Rowney (or equivalent)	#0 or 1
Forceps	Fisher Scientific (or Fine Science Tools)	NC9404145	Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging	MatTek	P35G-0-10-C	We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane	Sigma	51730-5ML	For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch)	Agar Scientific	AGG263	For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue)	Falcon tubes from Fisher Scientific	14-432-22	For preparation of heptane glue
Glass microscope slides	Agar Scientific	AGL4244	For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield	Leica (or equivalent)	M50	For dissection of Drosophila pupae
Microscissors	John Weiss International	103123	Miniature Research Scissors (straight)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser	Spectra-Physics (or Andor equivalent)	Model VSL-337ND-S	For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM)	Leica (or equivalent)	TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent)	Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber	Life Imaging Services (or equivalent)	"Microscope Temperature Control System"	Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name	Company	Catalog Number	Comments
Image Analysis Software
FRAP software module	Leica (or equivalent)	CLSM FRAP software module	For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software)	National Institutes of Health (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking"	National Institutes of Health (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software)	Perkin Elmer	Volocity 6.3	For image analysis
IMARIS (image analysis software)	Bitplane	IMARIS for Cell Biologists	For image analysis

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