طويلة الأمد في فيفو تتبع ديناميات الخلايا التحريضية داخل الخوادر المورفولوجية
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لإصلاح الجرح العيش-التصوير والاستجابة الالتهابية المرتبطة بها في عالية الدقة الزمانية في فيفو. هذا الأسلوب يستخدم الخوادر مرحلة التنمية المورفولوجية لتمكين الطويلة الأجل التصوير وتعقب السكان خلية معينة على مر الزمن ومتوافق مع الجينات بوساطة [رني] كفاءة المنظمة.
Abstract
خلال الاستجابة الالتهابية السريع إلى تلف الأنسجة، وخلايا نظام المناعة الفطرية يجند بسرعة إلى موقع الإصابة. مرة واحدة في الجرح، خلايا المناعة الفطرية أداء عدد من الوظائف الأساسية، مثل مكافحة العدوى وإزالة الأنقاض نخرية، وحفز ترسب مصفوفة. أجل الفهم الكامل لإحداث إشارات المتنوعة التي تنظم هذه الاستجابة المناعية، من الأهمية بمكان أن تلتزم بالسلوكيات المعقدة (والتفاعلات التي تحدث بين) متعددة الخلية السلالات الحية، وفي الوقت الحقيقي، مع الارتفاع القرار الزمانية. الشفافية الضوئية والصوبه الوراثية للأجنة المورفولوجية أقامت المورفولوجية كنموذج لا تقدر بثمن للعيش والصورة وتشريح الجوانب الأساسية لسلوك الخلايا التحريضية، بما في ذلك آليات تشتت التنموية، إزالة الجثث أبوبتوتيك و/أو مسببات الأمراض الميكروبية، والتجنيد للجروح. بيد العمل الأخيرة قد أثبتت الآن أن تستخدم في مرحلة لاحقة في دورة حياة المورفولوجية – عذراء المورفولوجية – يوفر عددا من المزايا المتميزة، بما في ذلك تحسين كفاءة [رني]، التصوير فترات أطول و عدد الخلايا المناعية أكبر كثيرا. يصف لنا هنا بروتوكولا لإصلاح الجرح التصوير والاستجابة الالتهابية المرتبطة بدقة عالية الزمانية في العيش المورفولوجية الخوادر. متابعة دينامية إعادة ابيثيلياليزيشن والتهاب، نستخدم عدد محدد في فيفو علامات مضيئة لكل من ظهارة وخلايا المناعة الفطرية. ونحن أيضا إثبات فعالية fluorophores الصور القابلة للتحويل، مثل كايد، لأثر مجموعات فرعية محددة الخلايا المناعية، لتعقب سلوكهم عندما تهاجر إلى، والعزم من موقع الإصابة.
Introduction
استجابة تحريضية الكفء والفعال محوري لأي كائن حي مكافحة العدوى وإزالة الأنقاض، وتنسق إصلاح أنسجة المصابين1. ورغم أن هذا الرد نتيجة حتمية لمعظم تلف الأنسجة، التهاب يتطلب التنظيم الصارم لأنه قد ربط استجابة التهابية غير ملائمة لمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية المختلفة (بما في ذلك عدم شفاء الجروح المزمنة، تندب المفرط، والاستعداد للإصابة بالسرطان)1،،من23. ونظرا لهذه الأهمية السريرية، من الأهمية بمكان التوصل إلى فهم أكثر تفصيلاً للآليات الجزيئية والخلوية قيادة الاستجابة الالتهابية من أجل وضع استراتيجيات لعلاج طائفة من المزمنة تحريضية ومؤشرات تشخيصية جديدة الظروف التي قد تحمي الأنسجة إصلاح من التهاب مطولة وغير ضرورية.
وفي السنوات الأخيرة، أصبحت المورفولوجية نظام الراسخة والقيم نموذجية تشريح سمات أساسية للاستجابة الالتهابية المصانة من الحشرات ل البشرية4،5. وفي الوقت الراهن، يقدم المورفولوجية الصوبة الوراثية أكبر بكثير مما هو ممكن حاليا في نماذج تجريبية أخرى (مثل الفئران أو الزرد)، تسمح بالتحوير الوراثي الزمانية الدقيقة في فيفو (لإلغاء تنشيط أو الإفراط إكسبرس أي الجينات من الاهتمام داخل أنواع محددة من الخلايا عند نقطة وقت إنمائية محددة) وسهولة على نطاق الجينوم شاشات6،7. تقليديا، تم إجراء معظم الدراسات تصوير لايف لالتئام الجروح والتهاب في المورفولوجية في المراحل الجنينية، كما الأجنة غير متحركة (خلافا لليرقات المورفولوجية أو البالغين) وشفافة بصريا والتي تمكن دقة عالية لا مثيل لها في فيفو التصوير8. وقد أتاح هذا الباحثين تصور توظيف سريعة وقوية من الخلايا المناعية الفطرية المورفولوجية (هيموسيتيس) إلى موقع الجرح استجابة للإصابة الميكانيكية أو المستحثة بالليزر ل ظهارة الجنينية9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-بالجمع بين هذه الدراسات العيش-التصوير التلاعب بالجينات، كشفت دراسات في الأجنة المورفولوجية الكثير من بروتينات الخلية المناعية الهامة التي تتحكم في سلوك الخلية الملتهبة في فيفو. على سبيل المثال، تم التعرف على هومولوج صعقة-1 دريبر (أيتام مجال التي تحتوي على بروتين) مهم ‘الضرر مستقبلات’ الذي يتوسط المورفولوجية تجنيد الخلايا المناعية في ح2س2-طريقة تعتمد على مواقع تلف15. مستويات دريبر داخل الخلايا المناعية بدوره تنظمها إشارات جنك المستحثة بالكالسيوم وارتفاع المصب apoptotic الجثة استيعاب12. هيموسيتي حركية أخرى يتطلب تغييرات cytoskeletal المعقدة لتنسيق الهجرة الموجهة نحو الجرح وهذا يتوقف على نشاط المنظمين cytoskeletal مثل الأكتين تجميع البروتين فاسسين16 والأسرة رو الصغيرة راك جتباسيس ورو9.
هو المورفولوجية الحشرات هولوميتابولوس الذي يمر بمراحل اليرقات والخوادر إضافية عقب embryogenesis، قبل بلوغ سن الرشد17. وقد وضعت عذراء المورفولوجية نموذجا إضافيا لتصوير العيش غير الغازية لمجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الحيوية، بما في ذلك الخلية الإنمائية الهجرة18وانقسام الخلية19و نمو الخلية20والعضلات 21من الانكماش. في الآونة الأخيرة، قد أنشئ كنموذج رواية التي لدراسة ديناميات الجرح إصلاح والتهاب في فيفو22،23.
كما هو الحال في المراحل الجنينية، الخوادر المورفولوجية غير متحرك وشفافة بصريا، بعد تشريح دقيق من تلك الحالات الخوادر كامد18. باستغلال هذه الشفافية الضوئية، أحد اتباع السلوك في فيفو خلايا المناعة الفطرية (هيموسيتيس) استجابة لتلف الأنسجة داخل الأنسجة الخوادر المورفولوجية ، مثل الجناح الخوادر22. يوجد الجناح الخوادر كبنية بيلاييريد بسيطة، تتكون من ورقتين الظهارية المسطحة الكبيرة التي ترتبط حول محيط الجناح؛ المساحة خارج الخلية بين هذه اثنين من طبقات طلائي مليئة hemolymph (الحشرات الدم) وعدد كبير من هيموسيتيس متحركة24. كما هو الحال في الأجنة، مشغلات الإصابة الميكانيكية أو المستحثة بالليزر ظهارة الجناح توظيف سريع من هيموسيتيس إلى موقع الإصابة23. ومع ذلك، هذه المرحلة الخوادر يوفر بعض المزايا المميزة للتصوير على مدى المراحل الجنينية في وقت سابق. يمكن تصويرها الخوادر المصابين على مدى فترات زمنية أطول بكثير (على الأقل 5 ساعات)، ويتوفر مزيد من منطقة الأنسجة لاضطراب تجريبية (مثل جيل جروح متعددة) وهناك إعداد أكبر بكثير من هيموسيتيس في هذه المرحلة ( توفير مسارات الخلية أكثر من مسافات إضافية لتحسين القدرة الإحصائية خلال التحليل الرياضي.) وعلاوة على ذلك، هو كفاءة المنظمة [رني] بوساطة الجينات إدخال تحسين كبير في مراحل الخوادر، السماح للعديد من الجينات تكون ‘طرقت إلى أسفل’ في أنسجة أو بطريقة محددة زمنياً مقارنة بالنهج التقليدي أكثر كله متحولة للأجنة.
من أجل تتبع ديناميات epithelialization إعادة الجرح والاستجابة الالتهابية المصاحبة داخل هذا النموذج الجديد الخوادر، يجب تمييز اثنين خلية مختلفة السكان: ظهارة الخوادر وخلايا المناعة الفطرية (المورفولوجية هيموسيتيس). عدد من علامات مختلفة (جدول المواد) متاحة بتسمية هؤلاء السكان خلية مختلفة اثنين–ويتوقف اختيار علامة على عملية خاصة لدراستها. بمناسبة ظهارة الخوادر، المورفولوجية الأسطر التي تحتوي على أما أوبيكويتوسلي أعرب بروتينات فلورية خضراء معلم ه-كادهيرين (أي تسميات تقاطعات أدهيرينس) تستخدم بشكل روتيني للإشارة إلى مواقف هوامش الخلية، أو بدلاً من ذلك، التجارة والنقل-معلم أكتين-ربط مجال موسين (أي تسميات cytoskeleton أكتين) لتصور نتوءات خاتم والرائدة في حافة الجرح الهوس أكتين. لتسمية هيموسيتيس المورفولوجية ، خاصة هيموسيتي حزب سام رانسى-Gal425 محرك الأقراص في التعبير عن النووي طلب تقديم العروض (لتعقب النووي) أو هيولى بروتينات فلورية خضراء موسين معلم التجارة والنقل (لتسمية cytoskeleton السيتوبلازم أو أكتين، على التوالي) أو وتستخدم فلوروفوري فوتوكونفيرتيبلي (مثل كايد). وفي الواقع، أنها غالباً ما فائدة استخدام متعددة الخلايا المناعية علامات في تركيبة، لتمكين تحليل متزامنة حركة النووية ومورفولوجيا الخلايا (انظر نتائج تمثيلية). بيد أن هذا البروتوكول تتضمن استخدام الخوادر المورفولوجية ، إلا تركيبات للبصمات الجينية التي قابلة للتطبيق حتى يمكن الاستفادة من مراحل منتصف الخوادر. أيضا، لن تكون الأرصدة الفتاكة الجنينية مناسبة. وهذا من غير المحتمل أن يكون هناك مشكلة عند التصوير عنصر التحكم (أو البرية من نوع) الخوادر ولكن من المهم النظر عندما تكون ترسيتها الجينات أو أوفيريكسبريسيد، لتقييم أثرها على إغلاق الجرح أو التهاب. في حالة الفتك المبكرة الناجمة عن ضربة قاضية الجينات (أو أوفيريكسبريشن)، Gal80إتس يمكن استخدام بناء للحث ضربة قاضية يحركها Gal4 لاحقاً في التنمية (انظر المناقشة).
في دراساتنا الأخيرة، الانتقال إلى مرحلة الخوادر مكننا من جمع الخلايا المناعية مسار بيانات كافية لتحليل سلوك التحريضية باستخدام النمذجة الرياضية المتطورة، التي بدورها قد سمح لنا أن نستنتج رواية تفاصيل الجرح إشارات جاذبة التحريضية23. على سبيل المثال، هذا النهج كشفت أن chemoattractant الجرح ينتشر ببطء من خلال الأنسجة الملتهبة في دور في/200 ميكرومتر2دقيقة، بمعدل الآن أبطأ مما سبق أن اقترح الجزيئات الصغيرة مرشح مثل ATP، أو يقال أن ح2س2 نشر26،27،،من2829؛ هذه الجزيئات الصغيرة ” الضرر ” المرجح بدلاً من ذلك بمثابة إشارات متساهلة. وعلاوة على ذلك، باتباع سلوك الخلايا المناعية الفطرية الطويلة الأجل كما أنها حل بعيداً عن جرحا أولية ويتعرضون لثانية (التي قدمت في مختلف تيميبوينتس بعد الأول)، أننا قد كشفت فترة مؤقتة ‘الحساسية’ خلال الخلايا المناعية التي هي الأعمى للإصابات اللاحقة23. عن طريق استغلال إمكانات التصوير الطويلة الأجل من طراز الخوادر، جنبا إلى جنب مع المقاييس المورفولوجية الجينية، أحد اتباع سلوك السكان الخلايا المناعية المحددة (مثل فقط تلك الخلايا المناعية المعينين إلى موقع الجرح) في ردا على الإهانات اللاحقة، واستخدام فلوروفوري فوتوكونفيرتيبلي30 التي يمكن التعبير عنها حصرا داخل الخلايا المناعية النسب23.
هنا يمكننا وصف بروتوكول لتصور ديناميات إصلاح الجرح والاستجابة الالتهابية المرتبطة الزمانية بدقة عالية باستخدام المعيشة الخوادر المورفولوجية . ونحن نقدم منهجية مفصلة لتغطية الخطوات المطلوبة لإعداد أولية الخوادر (التشريح والتركيب) وجرح الليزر بوساطة اللاحقة والوقت الفاصل بين التصوير. ونحن أيضا وصف استخدام الصور القابلة للتحويل فلوروفوريس للسماح بوصفها من خلية معينة محصنة ضد مجموعات فرعية في فيفو. على المدى الطويل، ونحن نتصور أن هذا النموذج الخوادر المورفولوجية الجديد سيفتح آفاقاً مثيرة لتشريح إشارات الديناميات المعقدة الكامنة وراء الاستجابة الالتهابية لتلف الأنسجة. عن طريق تطبيق التحليلات الإحصائية أكثر تطورا واحداً قد كشف ميزات للرد الذي خلاف ذلك سيظل تجريبيا غير قابل للوصول، بينما يمكن تحسين كفاءة [رني] تصلح لتطبيق الفرز على نطاق الجينوم داخل الخلايا المناعية في الجسم الحي لتحديد اللاعبين الرواية التي تنظم سلوك الخلايا المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
استجابة الالتهابات الحادة لتلف الأنسجة هي عملية معقدة وديناميكية للغاية أن من الضروري تدبير إصلاح الأنسجة المتضررة، بما في ذلك إزالة الحطام نخرية ومكافحة العدوى. لنفهم تماما وكشف الجوانب الأساسية لهذا الرد، من الأهمية بمكان أن يتم الدراسات المنجزة في فيفو على عينات حية ثلاثية الأبعاد من أجل السلوك الدقيق والتفاعلات المختلفة الخلية الأنساب المعنية الواجب اتباعها بدقة مع مرور الوقت. يسمح تحليل في الوقت الحقيقي لهذه الديناميات خلية وصفاً أكثر تفصيلاً لتعمل متحولة من النقاط الزمنية واحد ثابت من عينات الثابتة باستخدام تقنيات immunohistochemistry الكلاسيكية. تقليديا، استخدمت معظم الدراسات العيش-التصوير باستخدام نموذج المورفولوجية وراثيا تتسم المرحلة الجنينية للتنمية فرويتفلي نظراً للشفافية الضوئية والجمود بالمقارنة مع مراحل نمو لاحق4 , 5-ومع ذلك، في الآونة الأخيرة مجموعتنا وغيرها قد وضعت عذراء المورفولوجية كنموذج جديد لأداء عالية الدقة والتصوير الطويلة الأجل لإصلاح الجرح والتهاب في نفس الوقت في فيفو8،22 ،23. هذا النهج الناشئة يوفر إمكانيات مثيرة طويلة الأجل لكشف الجوانب الأساسية لسلوك الخلية الملتهبة ويمكن تكييفها أيضا للتحقيق في السلوك الديناميكي للأنساب الخلية الأخرى (مثل adipocytes المورفولوجية 38) بعد إصابة الأنسجة.
وهناك عدد من العوامل الحاسمة أثناء إعداد وتصوير الجرحى الخوادر المورفولوجية التي ستحدد نوعية نتائج التصوير الوارد وصفها أعلاه. يمكن القول أن الخطوة الأكثر صعوبة من بروتوكول وصف هو تشريح دقيق وتحديد المواقع بدقة الخوادر قبل إصابة والتصوير. الخوادر في هذه المرحلة الإنمائية هشة للغاية وبسيطة حتى التلف العرضي الخوادر خلال مراحل إعداد سيضعف إلى حد كبير التجربة؛ يجب أن يتم تجاهل أي الخوادر التي قد تتعرض للضرر غير المقصود من التجربة منذ هذا الضرر يمكن تنشيط استجابته التحريضية التي قد تؤدي إلى مزيد من تأثيرات واسعة الانتشار (أو حتى النظامية) على سلوك الخلية الملتهبة في أماكن أخرى في عذراء. بسبب التطوير المستمر الخوادر المستخدمة في هذه التجارب (التي يمر بها أنسجة كبيرة ترتيبات جديدة لإعداد الأنسجة لسن البلوغ)، سيتم نقل الخوادر في بعض الأحيان أثناء التصوير. المتداول الخوادر، مع ذلك، أكثر من المحتمل أن يحدث إذا الخوادر لا قد تصاعدت بشكل صحيح مع السطح تسطحاً من الجناح (أو الأنسجة الأخرى تصويرها) في اتصال مباشر مع كوفيرجلاس؛ ينبغي تقليل استخدام الغراء هيبتان استقرار الخوادر في الزجاج غطاء هذه الحركة غير مرغوب فيها. لهذا السبب، يجب أيضا أن الحذر الشديد لتجنب إزاحة الخوادر من مواقفها المنحازة بعناية عند نقل العينات بين المجاهر؛ ومن الناحية المثالية، سيلحق الليزر مما أسفر عن إصابة بالمجهر نفسه لاستخدامها لتصوير مرور الزمن اللاحقة وتحويل الصور.
بالإضافة إلى إتقان التشريح الخوادر وخطوات التركيب، سيكون النمط الوراثي الدقيق الخوادر المورفولوجية المستخدمة أثرا كبيرا على نوعية تصوير البيانات الناتجة. على سبيل المثال، عدد النسخ لسائق Gal4 وثوابت UAS (مثلاً UAS-التجارة والنقل أو كايد UAS) داخل وراثي الخوادر فردية ستحدد نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء تصوير اللاحقة. كقاعدة عامة، إنشاء نسخ أكثر من Gal4 أو UAS الحالي، زيادة المستوى الإجمالي للبروتينات الفلورية (مثل التجارة والنقل أو كايدى) داخل الأنسجة. بيد المستوى الأمثل من البروتين الفلورسنت ستكون إيجاد توازن دقيق بين رفع fluorescence الأنسجة بما فيه الكفاية للسماح للتصوير (تمكين استخدام صلاحيات ليزر أقل، الحد في فوتوبليتشينج والتصوير عبر تمديد الوقت عالية الجودة فترات) ولكن دون أن تسبب السمية الخلوية المستحثة fluorophore؛ العدد الأمثل من بنيات Gal4 و UAS في كل تجربة تختلف وفقا لبرامج معينة و fluorophores قيد الاستخدام. وينبغي الحرص على رفع الخوادر عند 25 درجة مئوية (أو أعلى، تصل إلى 29 درجة مئوية) لأن النظام Gal4-UAS هو درجة الحرارة حساسة ولن يكون فعالاً في أدنى درجات الحرارة31. من أجل تحقيق مستويات إضافية للسيطرة على الأنسجة أو خصوصية الوقت من Gal4-مدفوعة التعبير، قامع نظام Gal4 UAS Gal80 يمكن أيضا أن تدرج ضمن النمط الوراثي الخوادر39. Gal80 يمكن استخدامها أما لقمع النشاط Gal4 داخل نسيج معين (باستخدام Gal80 الخاصة بالانسجة) أو في وقت معين (باستخدام درجة حرارة Gal80 الحساسة). يمكن دمج نظام Gal4 UAS كذلك مع نظم أخرى ثنائية مستقلة (مثل ليزا-ليكساوب ونظم QF-QUAS ) لتوليد المورفولوجية التي لديها ثوابت متعددة (مثل فلوروفوريس، خطوط [رني] أو غيرها بنيات الوراثية) أعربت في وقت واحد في مجموعة من أنسجة مختلفة39.
استخدام هذا النموذج الخوادر المورفولوجية الجديد يوفر عددا من المزايا على نهج الجنين أكثر تقليدية. مقارنة لتصوير قصيرة الأجل (ما يصل إلى 3 ح) متاح في المرحلة 15 الأجنة (المرحلة الجنينية الأكثر إصابة الدراسات التي يتم تنفيذها)، يمكن تصويرها الخوادر لفترات أطول بشكل ملحوظ من الزمن (في رأس مال حتى سن البلوغ بعد 96 ساعة تنمية الخوادر ). وعلاوة على ذلك، يتم إعداد أكبر بكثير من هيموسيتيس (خلايا المناعة الفطريةالمورفولوجية ) موجودة داخل الأنسجة الخوادر (والمتاحة لتصوير) مقارنة بعدد محدود أكثر موجودة داخل الجنين وهذا سمح لنا بجمع أكبر بكثير تصوير البيانات المتعلقة بالسلوك هيموسيتي باستخدام نفس العدد الإجمالي للعينات. من الأهمية بمكان، بدوره، قد أتاح لنا تطبيق النمذجة الرياضية أكثر تطورا تحليل سلوك هيموسيتيس واستخراج ميزات الرواية عناصر الجرح واستجابة التحريضية التي أن بقيت خلاف ذلك تجريبيا يتعذر الوصول إلى23. وثمة ميزة أخرى من طراز الخوادر أكثر كفاءة بكثير من أن ضربة قاضية [رني] بوساطة الجينات في وقت سابق المراحل الجنينية، مما يتيح تحسين تحليل الأنسجة أو المنظمة الجينات محددة زمنياً باستخدام نظم ثنائي مثل نظام Gal4-UAS 39-الكفاءة [رني] في هذه المرحلة مما يفتح إمكانات لتنفيذ واسع النطاق (أو حتى غير منحازة على نطاق الجينوم) [رني] شاشات للبحث عن رواية اللاعبين المشاركين في إصلاح الجرح أو سلوك الخلية الملتهبة.
بيد الخوادر المورفولوجية واضح لا يمكن استخدامها لدراسة تعمل الناتجة عن الطفرات الوراثية التي الجنينية الفتاكة؛ ولذلك لا يزال يتعين إجراء الدراسات الفنية والتصوير ويعيش من الجينات التي تعتبر ضرورية لتطوير جنينية في الأجنة، إذا لم يكن ضربة قاضية [رني] بوساطة الجينات في الوقت أو طريقة محددة الأنسجة يسمح التنمية تحدث خلال المراحل الخوادر. ويظل الجنين أيضا نموذج الاختيار للدراسة والعيش والصورة ميزات معينة من السلوك الخلايا المناعية، منها تشتت التنموية للخلايا المناعية من أصلهم، والاتصال-تثبيط الحركة والبلعمه من الجثث أبوبتوتيك ولدت خلال النسيج التنموي النحت5،8 التي لم تراع في نماذج الخوادر. على الرغم من أن الدراسات المورفولوجية اليرقات والكبار قدمت نظرة ثاقبة هامة في الآليات التي يقوم عليها الجرح إصلاح والتهاب40،،من4142،43، وقد أثبتت الدراسات تصوير يعيش 44 في هذه المراحل صعبة بسبب طبيعتها متحركة طبيعة العينات. بينما يمكن تخديره اليرقات للسماح لفترات قصيرة للعيش-التصوير، نظراً للطابع المؤقت للتخدير، لقطات قصيرة فقط من الجرح يعيش إصلاح أو الاستجابة الالتهابية يمكن أن تصور45. الآن وضعت دراسة أجريت مؤخرا على بروتوكول محسنة التي تسمح بتصوير أطول أجلاً من اليرقات الجرح شفاء46، على الرغم من أن إعداد والتصوير لا يزال يبقى تحديا أكبر بكثير مما في الأجنة أو الخوادر. على المدى الطويل، ونحن نتصور أن باستخدام مرحلة النمو الأكثر ملاءمة لمعالجة كل مسألة محددة، دراسات في أربعة كل مرحلة من هذه المراحل المورفولوجية المختلفة-من الأجنة من خلال فترات اليرقات والخوادر إلى سن البلوغ (مع كل مزايا فريدة من نوعها والخاصة القيود)-سيوفر رؤى مكملة في الآلية الجزيئية والخلوية يقود إصلاح الجرح والتهاب.
في المستقبل، هذا البروتوكول لإصابة وتصوير طويلة الأجل الخوادر المورفولوجية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة مجموعة من الظواهر المرتبطة بالتهاب وإمكانات واسعة النطاق للكشف عن ميزات الرواية استجابة التهاب الجرح. مزيج تصوير طويل الأجل، جنبا إلى جنب مع تطبيق فلوروفوريس فوتوكونفيرتيبلي (مثل كايد)، ذات قيمة كبيرة لفهم ديناميات السلوك خلية المناعة الفطرية وعلى وجه الخصوص، أقصى أقل فهم مرحلة القرار رد التهاب الجرح. بوصفها على وجه التحديد أما الأفراد أو الفئات السكانية الفرعية من الخلايا المناعية (مثل هؤلاء المعينين لجرح) سيكون من الممكن لتحليل كيفية تأثير التعرض إلى جديلة واحدة البيئية (مثل الجثة أو إصابة) استجابة للخلية المناعية اللاحقة إلى وقت لاحق جديلة. يمكن تغيير سلوك هيموسيتيس المورفولوجية الملتهبة بالخبرات السابقة–على سبيل المثال، أنها هي تستعد للاستجابة إلى إصابة نسيج طريق البلعمه السابقة apoptotic الجثث خلال التنمية12 لكن يبقى أن نرى ما إذا كان حمل منبهات بيئية أخرى مماثلة فتيلة الأحداث. على الرغم من أن الدراسات الخوادر الجروح حتى الآن قد ركزت على استجابة الالتهابات الفطرية، الطراز الخوادر الجناح أيضا يوفر فرصة مثالية لكل صورة العيش وتشريح الآليات الأساسية لإصلاح الجرح الظهارية. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تكييف هذا الأسلوب التصوير الخوادر للتحقيق في السلوك الديناميكي للأنساب خلية أخرى استجابة للأنسجة الضرر38، أما في الجناح الخوادر نفسها أو الأنسجة الأخرى الخوادر يسهل الوصول إليها (مثل العينين أو الساقين أو الصدر). أخيرا، عن طريق الجمع بين الصوبة الوراثية من المورفولوجية جنبا إلى جنب مع سهولة تصوير الخوادر طويلة الأجل، إصلاح الظهارية رواية أو المنظمين التحريضية يمكن اكتشافه من خلال التطبيق غير منحازة على نطاق الجينوم تدق لأسفل النهج.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء مارتن، نوبس، ريتشاردسون ومعامل الخشب لمناقشة مفيدة. ونشكر أيضا مرفق بيويماجينج وولفسون (جامعة بريستول، المملكة المتحدة)، بلومينغتون مخزون المركز (جامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية)، ومركز الموارد المورفولوجية فيينا (بالنسبة للأرصدة المورفولوجية ) وفليبس (بالنسبة حتى الآن المورفولوجية جين التعليق التوضيحي). أيد هذا العمل “منحة المشروع لجنة نهر الميكونج” إلى بعد الظهر وقد (MR/J002577/1)، ويلكوم ترست زمالة كبار على قد وويلكوم ترست جائزة المحقق إلى بعد الظهر.
Materials
| Drosophila stocks | |||
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
| ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
| hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
| UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
| UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
| UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
| GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
| maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
| Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
| Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
| Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
| Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sample preparation and mounting | |||
| Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
| Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
| Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
| Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
| Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
| Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
| 50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
| Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
| Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
| Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser ablation and imaging | |||
| Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
| Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
| Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image Analysis Software | |||
| FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
| ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
| ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
| ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
| Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
| IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |
References
- Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
- Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
- Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
- Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
- Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
- Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
- Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
- Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
- Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
- Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
- Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
- Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
- Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
- Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
- Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
- Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages–a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
- Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
- Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
- Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
- Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. . Physik fur Biologen. , (1991).
- Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
- . Cell Biology by the Numbers Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015)
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
- Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
- Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
- del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
- Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
- Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239 (2004).
- Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
- Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972 (2016).
