Beta-Zell-Funktion ist wichtig für die Blutzucker-Homöostase, die bei einzelligen Auflösung mit einem genetisch codierte Reporter für Kalzium Zustrom ausgewertet wird.
Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse reagieren auf steigende Konzentrationen im Blut Glukose durch Sekretion des Hormons Insulins. Die Dysfunktion der Beta-Zellen führt zu Hyperglykämie und schwere, lebensbedrohliche folgen. Verstehen, wie die Beta-Zellen unter physiologischen Bedingungen funktionieren und welche genetischen und umweltbedingten Faktoren ihrer Dysfunktion verursachen könnten bessere Behandlungsmöglichkeiten für Diabetes-Patienten. Die Fähigkeit zur Messung der Kalziumspiegel im Beta-Zellen dient als ein wichtiger Indikator für Beta-Zellfunktion, als der Zustrom von Kalzium-Ionen löst Insulin-Freisetzung. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Überwachung der Glukose stimuliert Kalzium Zustroms im Zebrafisch Beta-Zellen mithilfe von GCaMP6s, ein genetisch codierte Sensor von Kalzium. Die Methode ermöglicht die Überwachung der intrazellulären Calcium-Dynamik mit einzelligen Auflösung in Ex Vivo montiert Inselchen. Die Glukose-Reaktionsfähigkeit von Beta-Zellen in der gleichen Insel kann gleichzeitig unter verschiedenen Glukosekonzentration erfasst werden, was darauf das Vorhandensein von funktionalen Heterogenität zwischen den Zebrafisch Beta-Zellen hindeutet. Darüber hinaus bietet die Technik hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung, der die oszillierende Natur der Kalzium-Zustrom nach Glukose-Stimulation zeigt. Unser Ansatz öffnet die Türen der Zebrafisch als Modell verwenden, um den Beitrag der genetischen und umweltbedingten Faktoren mit Beta-Zell-Funktion und Dysfunktion zu untersuchen.
Unser Blut-Glukose bleibt in einem engen Bereich, im großen Teil wegen der Funktion des endokrinen Pankreas. Die endokrine Rolle der Bauchspeicheldrüse erfolgt durch die Langerhans-Inseln, die Hormon-sezernierenden Zellen enthalten. Die Insulin-sezernierenden Beta-Zellen sind verantwortlich für die Verminderung der Blutzucker nach einer kohlenhydrathaltigen Mahlzeit. Unzureichende Insulin-Sekretion von Beta-Zellen führt zu Diabetes1, charakterisiert durch anhaltend hohe Blutzuckerwerte. Typ 1 und Typ 2 Diabetes, die derzeit weltweit mehr als 400 Millionen Menschen heimsucht, führt zur Morbidität und Mortalität2. Durch die Untersuchung der molekularen und ökologischen Faktoren, die Beta-Zell-Dysfunktion beitragen, werden wir besser verstehen, wie Typ-2-Diabetes beginnt und schreitet voran. Darüber hinaus bieten die Möglichkeit, menschlichen Stammzellen in funktionelle Beta-Zellen in Vitro zu unterscheiden eine Quelle neuer Beta-Zellen für Zelle-Ersatz-Therapien bei Typ 1 Diabetes. Zu diesem Zweck ist es wichtig, Beta-Zellfunktion und Reifung in genetische Modellorganismen zu studieren, um die notwendigen Kenntnisse für die Herstellung von funktionalen Beta-Zellen in einer Schale zu gewinnen.
Beta-Zell-Funktionalität kann durch Quantifizierung des Gesamtbetrags von Insulin abgesondert in Reaktion auf die Glukose-Stimulation auf der ganzen Insel-Ebene überwacht werden. Dieser kumulative Ansatz untersucht die Insel als eine einzelne Gruppe von Zellen ohne Differenzierung einer Zelle Einzelimmobilien. Allerdings ergab die Analyse der Glukose Antworten der einzelnen Beta-Zellen eine Vielfalt in die funktionellen Eigenschaften von Beta-Zellen und das Vorhandensein von Heterogenität3. Um die Funktion der einzelnen Beta-Zellen zu beurteilen, ist es möglich, die intrazellulären Veränderungen zu beobachten, die Insulin-Sekretion4führen. Insulin-Sekretion wird durch einen Eintrag von Glukose in die Beta-Zellen voraus. Die Glukose, die in den Beta-Zellen tritt ist schnell zu ATP verstoffwechselt. Höhere intrazelluläre ATP-Konzentration verringern die offene Wahrscheinlichkeit des ATP-sensitiven Kalium-Ionenkanäle, Beta-Zellen Depolarisation führt. Depolarisation öffnet die Spannung-empfindlichen Calcium-Ionenkanäle und intrazellulären Calcium erhöht. Kalzium löst wiederum Exozytose von Insulin, das in den Blutkreislauf freigesetzt und senkt den Blutzuckerspiegel durch die Förderung der glucoseverwertung5,6,7.
Verschiedene Strategien wurden angewendet, um die Funktion von Beta-Zellen, einschließlich der Überwachung der Membran potenzielle8, direkte Visualisierung der Insulin-Vesikel Exozytose9und Quantifizierung der intrazellulären Ca2 + zu untersuchen Zustrom stellvertretend für Glukose-Reaktionsfähigkeit10. Unter ihnen bietet Bildgebung des intrazellulären Ca2 + den Vorteil von Up-scaling der Analysis auf mehrere einzelne Zellen innerhalb der gleichen Insel11,12, zulassend die Glukose-Reaktionsfähigkeit zwischen im direkten Vergleich einzelnen Beta-Zellen. Intrazelluläre Ca2 + Konzentration kann mit Calcium-Sensitive Fluoreszenzfarbstoffen13 oder genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs)14überwacht werden. Während Kalzium-Indikators Farbstoffen fehlen Zelltyp Spezifität, GECIs in einem bestimmten Zelltyp spezifische Promotoren ausgedrückt werden kann. Darüber hinaus bietet die neue Generation von GECIs, z. B. GCaMP6, besseres Signal-Rausch-Verhältnis zusammen mit schneller zeitliche Dynamik15. Hier beschreiben wir das Dienstprogramm der neuen Generation von GECIs in bestimmten GCaMP6s, um Kalzium in Beta-Zellen bei einzelligen Auflösung zu visualisieren. Wir wenden diese Methode auf dem Zebrafisch primäre Inselchen als unser Modell der Wahl. Während der Embryonalentwicklung Beta-Zellen in der primären Insel stammen aus der dorsalen und ventralen Pankreas Knospen16. Die primäre Insel befindet sich an einer Stereotypen anatomische Position innerhalb der Zebrafisch-Bauchspeicheldrüse, ermöglichen die einfache Identifizierung und Isolierung. Beta-Zellen in primären Inselchen sind notwendig für Glukose-Verordnung, da ihre genetische Ablation zu Hyperglykämie17,18führt. Darüber hinaus werden diese Beta-Zellen während des frühen Zebrafisch Entwicklung19Glukose reagieren. Dieses Protokoll kann auch angewendet werden, Imaging der sekundären Inselchen, die während der Post-embryonalen Phase bilden. Das Protokoll ermöglicht Bild Beta-Zellen ex Vivo, in späteren Phasen der Entwicklung und unter definierten Glukosekonzentration.
Hier zeigen wir eine Technik für die Quantifizierung von Beta-Zellen Glukose Reaktionsfähigkeit bei einzelligen Auflösung. Dies wird durch die Überwachung der intrazellulären Calcium-Konzentration mit genetisch codierte Kalzium Kennzeichen, GCaMP6s ermöglicht. Beta-Zell-Aktivität ist durch die Montage der Insel in einer Fibrinogen-Thrombin-Form aufgenommenen ex Vivo . Ein wichtiger Schritt des Protokolls ist die Stabilität des Werkzeugs. Ausreichend Zeit muss für die Fibrinogen aufzulösen in die HBSS Lösung gegeben werden. Ohne diese wird die Form nicht ausreichend polymerisieren, um Stabilität während der Bildgebung Sitzung zu geben. Eine kleine Insel in Form von Fibrinogen-Thrombin montiert und eingetaucht in Zellkulturmedien kann für mindestens eine Woche (Daten nicht gezeigt) lebensfähig bleiben. Alternativen zu der Fibrinogen-Thrombin-Form, wie Low-Melt Agarose, können genutzt werden, um die kleine Insel22montieren. Ein weiterer kritischer Parameter ist die Zerlegung der Insel. Während dieses Schrittes muss das die Insel umgebende Gewebe entfernt werden, ohne zu verletzen oder stossen der Insel. Eine geschickte Dissektion kommt mit der Praxis.
Eine Einschränkung des imaging-Protokolls ist die Beschränkung auf einer konfokalen Ebene der Insel. Dies geschieht, um die Dynamik der Kalzium-Zustrom in einzelnen Beta-Zellen zu erfassen. Ein Z-Stack durch die gesamte Dicke der Insel führt um zu bildgebenden Geschwindigkeiten und oszillierenden Signalverlust von Einzelzellen zu niedrig. Diese Einschränkung könnte verbessert werden, mit Hilfe schneller wie Spinning-Disk-Mikroskopie, konfokale-Bildgebung um zu ermöglichen, die Kalzium-Dynamik in 3 Dimensionen zu erfassen. Eine weitere Grenze wäre in Vivo Calcium imaging12. Die transparente Art der Zebrafish Embryos oder die Verwendung von Pigment-weniger Stämme von Zebrafish Erwachsenen23 konnte die Möglichkeit für in-Vivo imaging in der Zukunft öffnen.
Die Darstellung der Beta-Zell-Aktivität mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht es, um die funktionelle Heterogenität zwischen den einzelnen Beta-Zellen zu untersuchen. Dieser Ansatz kann helfen, Licht auf die Existenz von Beta-Zellen Sub-Populationen. Mehrere Studien haben vor kurzem die Existenz von Sub-Populationen in der Beta-Zellen der nominell homogene24,25,26gezeigt. Ex-Vivo Bildgebung kombinierbar mit genetischen Reporter von der Sub-Bevölkerung als Reaktion auf Glukose zu charakterisieren. Darüber hinaus kann die Kombination von bildgebenden Setup mit pharmakologischen Stimulation für das Screening von Verbindungen ermöglichen, die Beta-Zellen Funktionalität verbessern könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann die hier vorgestellten Technik Quantifizierung und Vergleich der Glukose Reaktionsfähigkeit für individuelle Betazellen. Es bietet einen direkten Einblick in Beta-Zellen Funktionalität, ein wichtiger Parameter in der Entwicklung von Diabetes.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Mitglieder des Melua Lab für Kommentare auf das Manuskript, Mitglieder des Zentrums für Regenerative Therapien Dresden (CRTD) Fisch und Mikroskopie-Fazilität für technische Hilfe. N.N. wird unterstützt durch Mittel aus dem DFG-CRTD, Cluster of Excellence an der TU-Dresden, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) und dem Deutschen Zentrum für Diabetes-Forschung (DZD).
Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
Thrombin | Sigma | T4648 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |