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工程学

Método baseado em uma ponta da pipeta para semeadura pilhas Droplet Microfluidic plataformas

Published: February 11, 2019
doi:
10.3791/57848
, , , ,
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center,Stanford University

Summary

Este artigo apresenta um protocolo para semeadura escassa população de células usando pontas de pipetas para dispositivos microfluídicos de gotículas, a fim de proporcionar maior eficiência de encapsulação de células em gotículas.

Abstract

Entre vários projetos de plataforma de microfluidic frequentemente usados para análise celular, gota-microfluídica fornece uma ferramenta robusta para isolar e analisar as células a nível de célula única, eliminando a influência de fatores externos sobre o celular microambiente. Encapsulamento de células em gotículas é ditado pela distribuição de Poisson em função do número de células presentes em cada gota e o número médio de células por volume de gotículas. As células primárias, especialmente as células imunes, ou amostras clínicas podem ser escassas e encapsulamento de menor perda de células permanece desafiador. Neste trabalho, apresentamos uma nova metodologia que usa pontas de pipetas para carregar pilhas para dispositivos baseados em gotículas microfluidic sem perda significativa de células. Com vários tipos de células, demonstramos o encapsulamento de célula eficiente em gotículas que corresponde de perto à eficiência de encapsulação preditos através da distribuição de Poisson. Nosso método garante carga menor perda de células para plataformas microfluídicos e pode ser facilmente adaptado para análise a jusante única célula, por exemplo, para decodificar as interacções celulares entre diferentes tipos de células.

Introduction

Nos últimos anos, o uso de Microfluido como uma plataforma robusta e versátil para análise celular no nível da célula única tem aumentado rapidamente1. Estas plataformas fornecem rastreio com throughput alto de células únicas e moléculas biológicas com alta precisão e sensibilidade usando muito pequena amostra volume2,3,4. Entre diferentes tipos de projetos microfluídicos, plataformas baseadas em gotículas permitem alta produtividade análise de células únicas isolando-os em uma gota de fase aquosa, rodeada por uma fase imiscível que permite o controle preciso e exato sobre o celular microambiente5,6. Baseado em gotículas microfluídica dá a flexibilidade para isolar único ou Múltiplo-células em, ambos, aquosa e gotículas de hidrogel e é valiosa na investigação complexo comportamento celular, tais como proteínas secreção ou celular interações7, 8 , 9. sinalização e conversas cruzadas entre células do sistema imunológico podem ser influenciadas pela interação com outras células do microambiente10. Isolamento de células únicas em gotículas fornece um laboratório analítico isento de ruído eficaz, livre da influência de fatores ambientais externos para mais eficientes e precisos resultados11,12. Modificar o projeto de uma plataforma de gota-microfluidic com entradas múltiplas permite o encapsulamento de vários tipos de células para estudar interações celulares via celular-emparelhamento12,13.

O processo de encapsulamento de células em gotículas é aleatório e a taxa de encapsulamento de células pode ser estatisticamente determinada usando a fórmula para a distribuição de Poisson14,15. Esta taxa de encapsulação pode ser calculada considerando a taxa média de chegada de células na junção da gota e supondo-se que a chegada de cada célula é independente da chegada de outras células16. Apesar de chegada da célula independente não pode ser garantida, em casos de células esparsamente distribuídas, pode considerar-se a suposição de independência e a probabilidade de um droplet contendo uma ou mais células pode ser prevista em função do número de células presente em cada gota e o número médio de células por gotículas16,17. Uma vez que esta estimativa de encapsulamento celular em gotículas é dependente do número de células presentes em cada gota, um pode sugerir que aumentando a concentração de células na entrada irá aumentar o número médio de células presentes em cada gota 16. portanto, para garantir o encapsulamento de célula única, as concentrações de célula devem ser reduzidas mas isso muitas vezes leva a um grande número de gotículas vazio18.

Perda de células durante o carregamento por apego, sedimentação, e/ou aglutinação na seringa, tubulação ou dispositivo de produção é uma desvantagem comum responsável para o desvio de valores reais de encapsulamento do encapsulamento previstos valores19 . Este problema obtém mais exagerado quando semeadura raras células imunes ou amostras clínicas como eles já estão escassos na população e o encapsulamento de apenas algumas células, muito menores do que o esperado, não fornecem dados suficientes para análise experimental. Células dendríticas plasmocitoide (pDCs) são um subconjunto raro de células do sistema imunológico que só constitui aproximadamente 0,2 – 0,6 por cento do branco todo sangue de população celular20. Estas células secretam quantidades maciças de interferões após a ativação do tipo I e, assim, um papel crítico em respostas imunes21. Ao estudar o comportamento celular de tais células raras em gotículas, é imperativo para evitar perda de célula durante a semeadura de célula e encapsulamento22. Existem vários projetar desenvolvimentos relacionados que têm garantido o encapsulamento de células únicas em gotículas, usando métodos de encapsulamento ativo que utilizam diferentes forças físicas tais como forças de acústicas ou elétricas para geração de gotículas contendo Single-células23,24. No entanto, esses métodos têm suas próprias limitações em termos de produção de gotículas16.

Neste estudo, nós estabelecemos um método simples e robusto que contorna as deficiências dos métodos tradicionais para células simples ou múltiplos dispositivos microfluídicos de carga. Nosso método, inspirado por Rho et al., utiliza pontas de pipetas de tamanho diferente para a propagação de pequenos volumes de raras células imunes às plataformas de microfluidic gota sem perda de amostra significativa e produziu resultados que são coerentes com o teórico Previsões de25. Esta metodologia pode ser facilmente e com sucesso adaptados para diversas aplicações envolvendo microfluídica baseada em gotículas e aplicado para uma ampla variedade de tipos de células ou mesmo micropartículas.

Protocol

1. 3-entrada da fabricação do dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Medir a 40 g de base PDMS em um misturador de condicionamento do copo e adicionar 4 g de agente de cura de PDMS para o base reagente na taça, com cuidado, usando um conta-gotas. Coloque a taça no suporte da batedeira condicionado e medir o peso total da Copa com o titular. Defina o valor do peso centrífuga equilíbrio na mesa de mixagem de condicionamento em conformidade. Misture o agente de curando e base na batedeira condicionado a 2.000 rpm por 2 min, seguido de formação de espuma, a 2.000 rpm por 2 min. Prepare um barco de alumínio, com um diâmetro de aproximadamente o mesmo tamanho de uma bolacha de silicone de 100 mm. Coloque a bolacha de silício, fabricada para a réplica de processo, no barco de alumínio do molde e colocar essa configuração em uma placa de Petri (diâmetro = 120 mm, altura = 20 mm).Nota: O tamanho da caixa de Petri depende do tamanho da pastilha de silício. Retire o copo do porta e despeje pre-curado PDMS (conteúdo do copo), cuidadosamente, sobre a bolacha de silício. Coloque o prato de Petri, contendo o wafer de silício com a mistura PDMS pre-curado, num exsicador por cerca de 20 min para remover todas as bolhas de ar. Remova a placa de Petri após 20 min e verificar se há quaisquer bolhas de ar restante que pode ser removido. Coloque o prato de Petri em estufa, defina a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. Retire o prato de Petri do forno após 3 h e Retire cuidadosamente o PDMS curado do wafer de silício. Dispositivos PDMS cortados ao longo das linhas de corte, usando uma faca ou um bisturi. Buracos na entradas e na saída de cada dispositivo usando um perfurador de 1,2 mm. Limpe cada dispositivo PDMS com fita adesiva para remover qualquer poeira ou residual partes de PDMS. Opcionalmente, golpe com nitrogênio para remover pedaços PDMS residuais. Prepare lâminas de vidro, limpá-las com água de sabão, seguida pelo isopropanol e seco com nitrogênio. Ligação a um dispositivo PDMS limpo com uma lâmina de vidro limpa em um plasma asher para fechar as linhas de fluxo. Use as seguintes configurações: poder: 50 W, tempo: 45 s, tempo de atraso de sangria: 2 s, gás de processo: 1 gás (ar), ventilação: ambas as válvulas, Restricted desabafar tempo: 60 s, bomba spin-down tempo: 10 s, tempo de preensão de ventilação: 0 s, tempo de desligamento do gás: 1 s, Turbo bombeamento habilitado : 0. Desligue todas as outras linhas de gás.Nota: As configurações usadas para o plasma que Asher pode variar de acordo com a marca do plasma asher usado. Prepare a solução de silano pela adição de 50 µ l de silano (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltriethoxysilane) a 950 µ l de gases fluorados óleo.Nota: O silano é tóxico. Por favor, opere sob a coifa. Desenhe a solução de silano preparado em uma seringa, que é conectada a um tubo de Teflon. Salinize o dispositivo irrigando a solução de silano preparado através da saída do dispositivo. Coloque o dispositivo em um forno, situado a 65 ° C, por 30 min. Retire o dispositivo apetência do forno e irrigue silano excesso fora o dispositivo com óleo fluorado. Coloque o dispositivo em um forno, situado a 65 ° C, durante pelo menos 1 h concluir o processo de ligação.Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. 2. menor perda celular encapsulamento Colheita de células Ressuspender as células Jurkat T no meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) nas concentrações de 1.0×106 células/mL, 2.0×106 células/mL, 4.0×106 células/mL e 8.0×106 células/mL; pDCs em hematopoiéticos isento de soro meios de cultura (por exemplo, 15 X-VIVO) nas concentrações de 1.3×106 células/mL, 3.0×106 células/mL e 13.0×106 células/mL; A549 células em meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) em uma concentração de 1.0×106 células/mL.Nota: O tipo de células e a concentração de células pode variar com base na experiência. Rotulagem de células também pode ser feito com base na experiência. Carregamento de ponta para a geração de gotículas aquosa Prepare óleo fluorado com mistura de surfactante biocompatível de 3%, adicionando-se 3 mL de surfactante para 2 mL de óleo fluorado.Nota: A concentração do tensoativo adicionado ao óleo fluorado determina a estabilidade da emulsão para períodos de incubação diferentes. A concentração do tensoativo varia de acordo com a mídia utilizada para tipos de células específicos. Desenhe a mistura de fase de óleo em uma seringa (1ml). Retire as bolhas de ar da seringa e conectá-lo a um tubo de Teflon de comprimento adequado. Prepare uma seringa amostra desenho biocompatível de óleo mineral em uma seringa. Remover as bolhas de ar e conecte a seringa de uma tubulação de Teflon de comprimento adequado. Socar uma ficha PDMS com um diâmetro de 5 mm de uma laje PDMS curado.Nota: A laje PDMS curada pode ser preparada usando etapas 1.1 a 1.9. Use um wafer de silício simples em vez de um wafer de silício fabricados. Outro buraco no centro do plugue com um perfurador de 1 mm. Insira a tomada em uma ponta da pipeta 200 µ l, da extremidade maior, tal que ele se encaixa firmemente.Nota: Utilize uma ponta de pipeta 1.000 µ l de células maiores e maior volume de amostra. Para a ponta da pipeta 1.000 µ l, plugues de diâmetro variando entre 5 e 7 mm podem ser usados. Com um plug de diâmetro 5 mm, um volume de amostra de cerca de 400 µ l pode ser aspirado na ponta da pipeta. Se um plugue de maior diâmetro é usado (7 mm), mais volume de amostra pode ser aspirado (cerca de 900 µ l). Inserir o tubo, que é conectado à seringa, na ficha PDMS, que foi inserida na ponta da pipeta. Empurre o êmbolo da seringa lentamente para encher a ponta da pipeta conectado com óleo mineral. Expulsar todo o ar residual da ponta da pipeta. Abaixe a ponta da pipeta, conectada à seringa, na solução de amostra e aspirar cerca de 150 µ l de amostra na ponta. Repita as etapas 2.2.4 para 2.2.8 para preparar uma segunda seringa de amostra. Coloque cuidadosamente todas as seringas preparadas três na bomba de seringa. Insira ambas as pontas de pipetas, contendo a amostra, as duas entradas internas do chip PDMS. Introduza o tubo contendo a mistura de fase de óleo na entrada do exterior. Definir o valor das taxas de fluxo da bomba de seringa como segue: solução de fase contínua: 600 amostras de células µ l/h,: 100 µ l/h, cada. Insira e defina as dimensões da seringa.Nota: O diâmetro configurações irão variar com base no tipo de seringa. Ligue a bomba para liberar a solução da amostra através dos canais internos da fase óleo e dispositivo através do canal exterior do dispositivo. Conecte um tubo de tamanho apropriado para a saída para começar a recolher as gotas quando a formação de gotículas é estável. O momento da colheita varia de acordo com o experimento. Recolha as gotas em um tubo de bloqueio. Adicionar 200 µ l de meio RPMI (sem soro) em cima das gotas coletadas e incubar a amostra.Nota: Incubação tempo das gotas coletadas varia baseado no experimento. As gotas são coletadas em um tubo de bloqueio quando a análise baseada em citometria de fluxo ou isolamento é executado depois de recuperar as células de gotículas por quebrar a emulsão. É possível recolher as gotas em uma câmara de vidro se o experimento requer análise microscópica em gotículas. Recuperação de ruptura e célula para análise de fluxo cytometric da emulsão Prepare-se 20% 1H, 1H, 2H, solução de 2h-Perfluoro-1-octanol (PFO) (v/v) em óleo fluorado, adicionando 2 mL de FOP em 10 mL de óleo de flourinated. Remova o excesso de óleo do fundo do tubo da coleção, contendo as gotas, usando uma seringa. Adicione 100 µ l de solução de FOP de 20% para a emulsão para quebrar a emulsão e liberar as células encapsuladas em fase aquosa. Bata e misture rapidamente. Vórtice não fazer neste momento. Incube durante 1-2 min.Nota: A quantidade de PFO adicionado depende da quantidade de gotas produzidas. Continue adicionando PFO adicional até a camada de óleo é completamente dissolvida. Tenha em mente que a FOP é tóxico para as células e que também altas concentrações de PFO ou incubação muito longa em FOP pode levar a aumento da morte celular. Girar a solução em breve no mais baixo possível rcf por 30 s. Preparar 100 mL da solução fria Phosphate-Buffered salino (PBS) suplementado com 2% soro Fetal de bezerro (FCS) (2 mL de FCS em 98 mL de PBS). Pipetar 550 µ l da fração aquosa, imediatamente após a centrifugação e transferi-lo para um novo tubo de bloqueio contendo 500 µ l de solução de PBS fria suplementada com 2% de FCS, enquanto preparava na etapa 2.3.5. Deixe qualquer óleo residual afundar até o fundo do tubo novo bloqueio. Aspire 950 µ l da fase aquosa, contendo as células do tubo bloqueio, cuidadosamente, sem aspirar qualquer óleo residual e transferir a solução para um novo tubo de bloqueio. Gire para baixo as células no novo tubo de bloqueio por 10 min. Ressuspender as células em 300 µ l de solução de PBS fria suplementada com 2% de FCS, enquanto preparava na etapa 2.3.5.Nota: As células podem ser também re-suspenso em qualquer outra solução apropriada como mídia dependendo do experimento. Manche as células, com base na experiência, para análise usando citometria de fluxo. 3. célula de emparelhamento Colheita de células e coloração Contar as células Jurkat T, do frasco de cultura e gire para baixo as células a 1.500 rpm durante 5 min. Remover o sobrenadante e ressuspender 1.0×106 células em 1 mL de PBS para obter uma concentração de 1.0×106 células/mL. A quantidade de PBS adicionado depende da contagem de células. Repita as etapas 3.1.1 para 3.1.2 para preparar uma segunda amostra de células Jurkat T com a mesma concentração de célula. Lave as duas amostras duas vezes com 1 mL de PBS a 1.500 rpm durante 5 min. Re-suspenda uma amostra de células com tintura de éster (CFSE) grufo de carboxyfluorescein 1,25 µM e a outra amostra de célula com 1,25 µM até vermelho de tintura ou 1,25 µM tintura de proliferação de célula em uma concentração de células de 1.0×106 células/mL. O total de solução de coloração é 1ml por 1.0×106 células.Nota: As células podem ser rotuladas com corantes diferentes dependendo dos filtros disponíveis no citômetro de fluxo ou o microscópio de fluorescência. Incubar as amostras de células com corantes durante 10 minutos a 37 ° C. Pare a reação de coloração, adicionando 1 mL de gelo frio FCS depois de 10 min. Lave as amostras de célula duas vezes com 1 mL de PBS a 1.500 rpm durante 5 min. Re-suspenda as amostras de células em meios RPMI em uma concentração de 10.0×106 células/mL, para cada cor. Carregamento de ponta para a produção de gotículas de hidrogel agarose para celular emparelhamentoNota: Para célula emparelhamento usando gotas de hidrogel de agarose, manter a temperatura do sistema entre 27 ° C e 37 ° C durante o gota geração coleção processo e para evitar a coagulação do hidrogel e para garantir a viabilidade celular9. Dissolver a coagulação ultra-baixa temperatura agarose aquecendo até 75 ° C em PBS em uma concentração de 4% (p/v) e agitar a mistura por 20 min. Misture a solução de agarose com rotulados Jurkat T células para produzir uma concentração de agarose 2% (p/v). Repita isto para a outra amostra com células rotuladas de forma diferente. Prepare o óleo fluorado com mistura de surfactante de 2%, adicionando 20 mL de surfactante para 30 mL de óleo fluorado (mistura de fase de óleo). Siga os passos 2.2.2 – 2.2.14.Nota: Devido à natureza viscosa de baixo fusão agarose e a garantir uma produção estável da gota, defina o valor das taxas de fluxo as bombas de seringa da seguinte maneira: óleo mistura de fase: 2.000 amostras de células µ l/h,: 200 µ l/h. entrar e ajustar as dimensões da seringa. Recolher as gotas em um tubo de bloqueio e incubar as gotas a 4 ° C por 60 min. Quebra de emulsão e recuperação de grânulo de agarose para análise de FACS Após a incubação de gotas para 60 min, remova o excesso de óleo do tubo de fechamento, contendo as gotas, usando uma seringa. Adicione 200 µ l de FOP para remover as gotas a interfase do óleo.Nota: A quantidade de PFO adicionado ao tubo depende da quantidade de gotas produzidas. Continue adicionando PFO adicional até a camada de óleo é completamente dissolvida. Lave os grânulos de agarose coletados duas vezes com 1 mL de PBS fria para remover o óleo completamente por centrifugação a 1.500 rpm durante 10 min. Analise contas de agarose coletados usando citometria de fluxo.Nota: Também é possível observar as contas sob um microscópio de fluorescência.

Representative Results

Para nossos experimentos, foi utilizado um dispositivo de base microfluidic PDMS 3-entrada com a altura de 25 mícrons (Figura 1). Nesta configuração de dispositivo, usamos a entrada externa para nivelar o óleo com surfactante e as duas entradas internas para nivelar as fases aquosas com suspensões celulares ou mídia. Após a geração e a coleção, as gotas são incubadas por um par de horas chip antes a jusante análise usando citometria de fluxo. Durante o período de incubação, soro componentes presentes na mídia podem interagir com o surfactante e causar gotículas tornam-se instáveis e desintegram-se. Portanto, é importante adicionar uma concentração otimizada de surfactante ao óleo fluorado. Testamos a estabilidade das gotas monodispersas contendo hematopoiética media serum-free cultura suplementado com 2% de soro humano com diferentes concentrações de surfactante em óleo fluorado. Pode-se inferir da Figura 2 que essas gotículas monodispersas são altamente estável por até 24 horas quando pelo menos 3% de surfactante é adicionado para a fase de óleo. Resultados semelhantes foram obtidos com mídia RPMI com e sem a adição de 10% FCS (dados não mostrados). Portanto, a estabilidade da gota é altamente dependente da concentração de surfactante ideal quando se trabalha com diferentes fontes de meios de cultura e componentes do soro. Para demonstrar a eficiência de encapsulação de nossa abordagem, nós primeiro semeado as células usando tubos conectados para seringas, que é a abordagem mais convencional para a propagação de células(Figura 3). Nós colhidas células Jurkat T em diferentes concentrações de 1.0×106 células/mL, 2.0×106 células/mL e 4.0×106 células/mL e obteve uma eficiência de encapsulação que foi menor do que os valores previstos (Figura 3B). Em 1.0×106 células/mL, a fração de gotículas que continha uma única célula foi 2,5%, o que não aumentou nem ao usar concentrações mais elevadas de célula. Para aumentar a eficiência da célula de carga, nós modificado nossa abordagem anterior e montado a tubagem na metade do comprimento de um tripé de elevado e carregado a suspensão de células na parte que estava ligado ao dispositivo de PDMS(Figura 4). Usando essa abordagem, nós encapsulado células Jurkat T em diferentes concentrações de 1.0×106 células/mL, 2.0×106 células/mL e 4.0×106 células/mL e também raras pDCs em diferentes concentrações de 1.0×106 células/mL, 2.0×106 células/mL e 12.0×106 células/mL. Esperávamos o encapsulamento melhorou taxas, impedindo a sedimentação celular com este método. No entanto, em todas as concentrações testadas, os resultados experimentais foram muito menores que a predita Poisson valores (Figura 4B e Figura 4C). Usando a nossa abordagem de carregamento de ponta nós aperfeiçoamos nossas taxas de encapsulamento de célula para obter resultados experimentais coerentes com os valores estatisticamente previsível (Figura 5A). Para as diferentes concentrações de células Jurkat T, a eficiência de encapsulação obtidos correspondido nossos valores calculados em todas as concentrações (Figura 5B). Surpreendentemente, mesmo com células aderentes como pilhas do tumor A549, que tendem a aglutinar-se, observamos uma eficiência de encapsulação melhorou ligeiramente em uma concentração celular de 1.0×106 células/mL (Figura 5-C). Também avaliamos a eficácia do nosso sistema para encapsular pDCs menos disponíveis e escassos em concentrações diferentes da célula de 1.0×106 células/mL, 3.0×106 células/mL e 13.0×106 células/mL (Figura 5-D). Para facilitar o carregamento de possivelmente maiores volumes superiores a 200 µ l, por exemplo, ao trabalhar com linhas de célula ou células imunes primárias mais abundantes, também investigamos a eficiência de encapsulação de célula usando dicas de 1000 µ l (azuis). Temos demonstrado que esses 1.000 dicas µ l deram uma eficiência de encapsulação semelhantes em comparação com as dicas de 200 µ l (amarelo) (Figura 5E). Dependente da microplaqueta design e pesquisa pergunta à mão, nossa dica técnica de carregamento pode ser usada para carregar as células por meio de uma entrada, para sondar a heterogeneidade celular, ou múltiplas entradas em paralelo, para decodificação interacções celulares. Comparamos o carregamento de células Jurkat T (em uma concentração de 10.0×106 células/mL) de uma entrada para duas populações diferentemente rotuladas de células Jurkat T (em uma concentração combinada de 10.0 x106 células/mL) de duas entradas (Figura 6 A e 6 da figuraB). Durante o encapsulamento, as gotas foram geradas usando coaguladas ultra-baixa temperatura agarose e gelificada após a produção de grânulos de hidrogel de agarose de forma que permitiu a análise subsequente a jusante através de microscopia e fluxo cytometry (Figura 6 C e 6 figuraD). A análise microscópica revelou que a célula emparelhamento foi alcançado em diferentes combinações, indicando para célula alto throughput emparelhamento (Figura 6C). Além disso, a análise da mesma população de hidrogel grânulos por citometria de fluxo revelou que grânulos sem células poderiam ser separados de missanga com células com base em avançar a distintos (FSC, tamanho) e sideward (SSC, granularidade) padrão de dispersão (Figura 6 D). Retenção sobre a população de grânulos sem células confirmou uma falta de encapsulamento da célula pela ausência de sinais fluorescentes. Além disso, gating na população com células grânulo revelou a existência de múltiplos indicativo de sub-populações para o encapsulamento de forma diferente rotulados células Jurkat T. Nossos resultados demonstram que célula eficiente emparelhamento pode ser alcançado, com base em ambos microscópicas fluxo cytometric análise e mostrou uma eficiência de encapsulação ligeiramente aumentada em comparação com a previsão de Poisson (Figura 6E). Figura 1 . PDMS com base gota microfluidic dispositivo com três entradas e uma saída. O dispositivo consiste de três entradas para a fase contínua óleo, meios de cultura celular e suspensão de células, respectivamente. As gotas geradas são coletadas na saída. As amostras de fluxo laminarly para a junção de fluxo-foco, onde eles são encapsulados em gotículas. As entradas, filtro estruturas Segure partículas grandes, como proteínas ou agregados de células de volta. O diâmetro das lacunas na estrutura do filtro são indicadas por linhas azuis. O diâmetro dos canais para o bocal de produção são indicadas por linhas vermelhas. A altura do canal do chip inteiro foi 25 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2 . Estabilidade da gota em 24 horas. Os gráficos mostram a área de gotículas contendo meios de cultura hematopoiéticos isento de soro + 2% de soro humano, ao longo do tempo para três diferentes concentrações de surfactante A) 0,5% B) 3% C) 5%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 . Tubo com base celular carregando a abordagem. Células Jurkat-T são carregadas em diferentes concentrações para o dispositivo usando uma seringa conectada à tubulação. A) a ilustração mostra a configuração experimental B) a taxa de encapsulação de célula conforme determinado pela microscopia de luz. Pontos: experimentalmente determinados valores; Fechado linhas: distribuição de Poisson. Barra de erro representa o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 . Encapsulamento de vários tipos de células em concentrações diferentes, usando um tubo vertical de carregamento abordagem. Células Jurkat T e os pDCs (de concentrações diferentes) foram encapsulados para determinar a eficiência de encapsulação de célula. A) a ilustração mostra a configuração experimental para a abordagem de carregamento o tubo vertical. B) o gráfico mostra a eficiência de encapsulação de Jurkat T células. C) o gráfico mostra a eficiência de encapsulação do PDC. Pontos: experimentalmente determinados valores; Fechado linhas: distribuição de Poisson. Barra de erro representa o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5 . Dica a abordagem de carregamento para encapsular tipos diferentes de células. A) ilustração esquemática da ponta da técnica de carregamento. B) o gráfico mostra a eficiência de encapsulação de células Jurkat. C) o gráfico mostra a eficiência de encapsulação de células A549. D) o gráfico mostra a eficiência de encapsulação do PDC. E) o gráfico mostra a eficiência de encapsulação de Jurkat T células usando 200 pontas de pipetas µ l (amarelas) e pontas de pipetas 1.000 µ l (azul). Pontos: experimentalmente determinados valores; Fechado linhas: distribuição de Poisson. Barra de erro representa o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 . Célula de emparelhamento em gotículas. A) ilustração esquemática da ponta da abordagem para o emparelhamento de células distintas de 2 entradas em gotículas de carregamento. B) o gráfico mostra o encapsulamento de Jurkat T células usando a entrada de uma ou duas entradas em paralelo. A concentração de célula para uma dica é 2.0×106 células/mL e a concentração de células para duas dicas ambos 1.0×106 células/mL. Pontos: experimentalmente determinados valores; Fechado linhas: distribuição de Poisson. C) sobreposições de microscópico a fluorescência de grânulos de hidrogel e rotuladas células Jurkat T. D) O gráfico mostra a análise do fluxo cytometric de células pareadas em grânulos de hidrogel de agarose. O enredo demonstra tanto dispersão para a frente e lateralmente scatter. E) comparação de números de telemóvel em hidrogel de agarose beads detectadas por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Bares: significa valor; Bigodes: erro padrão da médio, n ≥ 4. Barra de erro representa o erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Neste protocolo, temos demonstrado uma técnica eficiente e simples para carregar e encapsular células em gotas para análise do elevado-throughput, unicelulares e executar célula controlada emparelhamento para estudos de interação celular. Além disso, temos em relação a várias abordagens convencionais para carregar pilhas de dispositivos microfluídicos e mostrou que a nossa dica de abordagem de carregamento é uma técnica mais eficiente em comparação com outros métodos.

Estou estudas amostras clínicas ou tipos de células raras escassos em número por microfluídica baseada em gotículas possuem alguns desafios inerentes. Como também temos demonstrado, células tendem a sedimentos em seringas e superfície da tubulação, desse modo, impedindo o encapsulamento celular para se conformar com os valores previstos. Para contornar este problema, alguns grupos usam barras de agita nas seringas. No entanto, quando usando populações de células raras e limitadas, o volume total da célula também é limitado, assim, limitar a utilização de seringas grandes e mexendo bares. Além disso, também substituímos mais comumente utilizados tubos com Teflon revestido tubulação para evitar penhora de célula, mas esse método não melhorar os resultados e se o tubo for muito longo, o problema da fixação da célula agrava (dados não mostrados). Alternativamente, usamos um tubo vertical, abordagem de carregamento onde as células foram carregadas na tubulação e não na seringa para evitar a perda de células em volumes de seringa grande. Usando esta técnica, células com volume de amostra pequena pode ser carregado, por exemplo, os pDCs que são raros e limitados. Além disso, a amostra do tubo é carregada para o dispositivo na vertical para evitar a sedimentação de célula. O tubo usado para célula semeadura tem dimensões pequenas e pode ser comparado de microcanais. O fluxo na tubulação de pressão conduzido e segue um perfil de velocidade parabólica26. Isto implica que a velocidade de fluxo máximo está no centro do tubo e a velocidade mínima é nas bordas da tubulação27. Quando uma população de células através da tubulação de lavagem, o gradiente de velocidade faz com que as células ser empurrado para as extremidades, onde se instalam para baixo, porque a velocidade no limite é próximo de zero. A sedimentação ou liquidação de células na tubulação, desse modo, reduz a eficiência de encapsulação conforme os resultados representativos, onde os dados experimentais não correspondeu com o modelo previsto.

Outra solução adaptada comumente usada pelos cientistas, trabalhando com gotículas microfluídica, é aumentar a densidade de meios de cultura a célula pela adição de densidade correspondentes reagentes tais como Iodinaxol para evitar a sedimentação de célula em seringas19. No entanto, densidade correspondentes reagentes pode influenciar o comportamento celular e adversamente afetar a secreção de citocinas por células (dados não mostrados)28.

Apesar de várias pequenas e grandes modificações na célula convencional, técnicas de carregamento mostraram ligeira melhoria na eficiência de encapsulação, os resultados experimentais obtidos ainda não combina com os cálculos teóricos. No entanto, com a abordagem de carga de ponta podemos a superar as limitações dos métodos anteriores e eficiência de encapsulação regidas pelas estatísticas de Poisson. Esta técnica não é apenas vantajosa para suspensão de células de carga, mas também pode ser aplicada para células aderentes, tais como queratinócitos primários e A549 chips microfluídicos de carga. Quando usando linhas de células abundantes, por exemplo, A549, K562, etc., maior volume de amostra pode ser usado. Portanto, dependendo do volume da amostra, tamanhos diferentes de pontas de pipetas também podem ser usadas e esta técnica simples pode ser adaptada tanto para encapsulamento de célula única e encapsulamento de células múltiplas.

Enquanto a concentração de células de baixa é necessária para garantir o encapsulamento de células únicas em gotículas, altas concentrações de células são desejadas para aumentar o número médio de células encapsuladas em cada gota de estudos relacionados à célula de emparelhamento. Existem vários métodos de célula única que têm sido descritos anteriormente para as células imunes par microfluidic fichas ou microfabricated nanowells29,30,31. Na gota microfluídica, estatísticas de Poisson determina que 1:1 a célula emparelhamento de dois diferentes tipos de células pode ser alcançada em concentrações de célula ideal. Com base na previsão Poisson, há também uma probabilidade que gotículas podem conter outras combinações. Enquanto o emparelhamento de 1:1 célula pode ser desejável para estudar interações celulares em nível de célula única e resulta em maior compreensão celular, emparelhamento múltiplo de célula também tem grandes vantagens. Permite para compreender a influência de várias células de um tipo de célula no outro tipo de célula. Conversas cruzadas entre diferentes células imunes ajudam a gerar uma resposta imune eficaz contra várias infecções e patógenos e também adiciona a robustez de nosso sistema imunológico32. Como tal, a comunicação celular pode ser interrogada com alta precisão em contextos distintos, por exemplo, 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, etc. rendimento maior compreensão sobre como único ou pares de células controlam a indução de respostas imunes. Isto é particularmente interessante para estudar, por exemplo, a capacidade das células assassinas naturais ou as células T citotóxicas serialmente matar suas células de destino correspondente.

Como discutido, para múltiplos encapsulamento das células em gotículas, altas concentrações de célula são desejadas. No entanto, quando células de carga de uma entrada para o encapsulamento de célula, concentrações mais altas de amostra de células podem causar células para agregar à entrada. Isso resulta em taxas mais baixas de encapsulamento e maior desvio dos valores teóricos. Para contornar este problema, as células podem ser carregadas de duas entradas separadas também. Teoricamente, seria possível desenvolver outros dispositivos microfluídicos com entradas múltiplas para atingir níveis ainda mais altos de encapsulamento de célula onde uma média de x o número de células é garantida. Neste estudo, investigamos a eficiência de encapsulação de células Jurkat T quando carregado de uma entrada e duas entradas, usando a mesma concentração total e obteve eficiência de encapsulação semelhante. Esta modificação permite aos pesquisadores par diferentes tipos de células no chip.

Enquanto este método auxilia na células para dispositivos microfluídicos sem perda significativa de células de carga, existem certas precauções que precisam ser mantidos em mente. Quando encher as seringas com óleo mineral e aspirar a amostra de célula em pontas de pipetas, incorporação de bolhas de ar deve ser evitada e todo o sistema deve ser livre de ar. Também é importante manter em mente que o óleo mineral não deve misturar com a amostra. Pontas de pipetas, contendo amostras, devem ser inseridas firmemente nas entradas do dispositivo microfluidic, com extrema precaução, para evitar fugas e ainda mais a incorporação de bolhas de ar. Para resumir, o carregamento de ponta é uma técnica simples, porém robusta que permite a análise do elevado-throughput do comportamento celular através do encapsulamento de células sem perda significativa de células em uma maneira cost-effective. Quando usado com concentrações de amostra ideal na entrada, esta abordagem de células com pontas de pipetas de carga é muito flexível e pode ser adaptada para diferentes tipos de células, especialmente para raras células imunes primárias, para obter maior eficiência de encapsulação, perto de modelos de previsão.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Eindhoven University of Technology, pelo generoso apoio.

Materials

1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture
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Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).
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