ماصة-تلميح إلى أسلوب للخلايا البذر لمنصات موائع جزيئية الحبرية
Summary
تعرض هذه المقالة بروتوكول لبذر السكان الشحيحة للخلايا باستخدام ماصة-نصائح لأجهزة موائع جزيئية الحبرية من أجل توفير مستوى أعلى من الكفاءة تغليف الخلايا في قطرات.
Abstract
يوفر الحبرية-ميكروفلويديكس بين مختلف التصاميم منصة موائع جزيئية كثيرا ما تستخدم لتحليل الخلوية، أداة قوية لعزل وتحليل الخلايا على مستوى الخلايا المفردة من خلال القضاء على تأثير العوامل الخارجية على الخلوي المكروية. تغليف الخلايا في قطيرات تمليه توزيع بواسون كدالة لعدد الخلايا الموجودة في كل قطره ومتوسط عدد الخلايا في حجم التجميعية. يمكن أن تكون الخلايا الأولية، لا سيما الخلايا المناعية، أو العينات السريرية النادرة وتغليف أقل خسارة من خلايا لا تزال صعبة. في هذه الورقة، نقدم منهجية جديدة يستخدم ماصة-نصائح لتحميل خلايا للأجهزة المستندة إلى الحبرية موائع جزيئية دون فقدان كبير للخلايا. مع مختلف أنواع الخلايا، علينا أن نظهر تغليف خلية فعالة في قطرات يتوافق عن كثب مع كفاءة التغليف التي تنبأ بها توزيع بواسون. لدينا أسلوب يضمن تحميل الخسارة أقل من الخلايا إلى منصات موائع جزيئية ويمكن تكييفها بسهولة لتحليل المتلقين للمعلومات من خلية مفردة، مثلاً، فك التفاعلات الخلوية بين أنواع مختلفة من الخلايا.
Introduction
في السنوات الأخيرة، استخدام ميكروفلويديكس كمنصة قوية ومرنة لتحليل الخلوية على مستوى الخلية الواحدة على زيادة سرعة1. وتوفر هذه المنصات الفرز الفائق للخلايا المفردة والجزيئات البيولوجية مع عالية الدقة والحساسية باستخدام عينة صغيرة جداً حجم2،،من34. من بين أنواع مختلفة من التصاميم موائع جزيئية، تمكين الأنظمة الأساسية المستندة إلى الحبرية التحليل الفائق للخلايا المفردة بعزلهم في الحبرية مرحلة مائي محاط بمرحلة قابلة للامتزاج الذي يسمح بالتحكم الخلوي دقيقة ودقيقة المكروية5،6. ميكروفلويديكس المستندة إلى الحبرية يعطي المرونة لعزل مفردة أو متعددة الخلايا في كليهما، مائي وقطرات المائية وهي ذات قيمة في سبر السلوك الخلوية المعقدة، مثل البروتين إفراز أو الخلوية التفاعلات7، 8 , 9-الإشارات وعبر الحديث بين الخلايا المناعية يمكن أن يتأثر بالتفاعل مع خلايا أخرى في المكروية10. عزل الخلايا المفردة في قطرات يوفر مختبر خالية من الضوضاء تحليلية فعالة، خالية من تأثير العوامل البيئية الخارجية لأكثر كفاءة ودقة النتائج11،12. تعديل تصميم منصة الحبرية-موائع جزيئية مع مداخل متعددة تسمح تغليف العديد من أنواع الخلايا لدراسة التفاعلات الخلوية عن طريق الأقران الخلية12،13.
عملية تغليف الخلايا في قطرات عشوائية ويمكن تحديد معدل تغليف الخلايا إحصائيا باستخدام صيغة ال14،توزيع Poisson15. يمكن أن تقدر بالنظر في المعدل المتوسط لوصول الخلايا عند مفرق الحبرية هذا المعدل لتغليف وافتراض أن وصول كل خلية مستقلة عن وصول أخرى خلايا16. على الرغم من أنه لا يمكن ضمان وصول خلية مستقلة، وفي حالات قليلة توزع الخلايا، يمكن اعتبار افتراض الاستقلال ويمكن التنبؤ باحتمال معالجة تجميعية تحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا كدالة لعدد الخلايا موجودة في كل قطره ومتوسط عدد الخلايا كل قطره16،17. نظراً لهذا التقدير لتغليف الخلوية في قطرات اعتماداً على عدد الخلايا الموجودة في كل قطره، واحد يمكن أن تشير إلى أن زيادة تركيز الخلايا في المدخل سيزيد متوسط عدد الخلايا الموجودة في كل قطره 16. لذلك، لضمان تغليف خلية مفردة، تركيزات الخلية يجب خفض لكن هذا كثيرا ما يؤدي إلى عدد كبير من قطرات فارغة18.
فقدان الخلايا أثناء التحميل بالمرفقات، الترسيب، و/أو التثاقل في المحاقن، أنابيب، أو إنتاج الجهاز عيب مشتركة مسؤولة عن انحراف القيم الفعلية تغليف من القيم المتوقعة تغليف19 . يحصل على زيادة مبالغ هذه المشكلة عند البذر الخلايا المناعية النادرة أو العينات السريرية كما هم بالفعل نادرة في السكان والتغليف من بضع خلايا فقط، أقل بكثير مما كان متوقعا، لا توفر بيانات كافية لتحليل تجريبي. بلاسماسيتويد الخلايا الجذعية (pDCs) هي مجموعة فرعية نادرة من الخلايا المناعية التي تشكل فقط حوالي 0.2-0.6 في المائة البيض كامل الدم خلية السكان20. هذه الخلايا تفرز كميات هائلة من النوع الأول من تداخلين عند التنشيط ومما لعب دوراً حاسما في الاستجابات المناعية21. عند دراسة سلوك هذه الخلايا النادرة في قطرات الخلوية، من الضروري لمنع فقدان الخلية خلال الخلية البذر والتغليف22. وهناك تصميم العديد من التطورات ذات الصلة التي كفلت التغليف للخلايا المفردة في استخدام أساليب التغليف النشطة التي تستخدم مختلف القوى المادية مثل القوات الصوتية أو الكهربائية لجيل قطرات تحتوي على قطرات خلايا مفردة23،24. ومع ذلك، هذه الأساليب قد القيود الخاصة بها من حيث إنتاج قطره16.
في هذه الدراسة، قمنا بإنشاء أسلوب قوي ومباشر أن تلتف أوجه قصور الأساليب التقليدية لتحميل خلايا مفردة أو متعددة للأجهزة موائع جزيئية. أسلوبنا، مستوحاة من رو et al.، يستخدم نصائح ماصة الحجم بشكل مختلف لبذر كميات صغيرة من الخلايا المناعية النادرة إلى منصات موائع جزيئية الحبرية دون فقدان عينة كبيرة، وأسفرت عن نتائج متسقة مع النظرية 25من التنبؤات. هذه المنهجية يمكن بسهولة بنجاح تكييفها للعديد من التطبيقات التي تشمل ميكروفلويديكس المستندة إلى الحبرية وتطبيقها لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا أو حتى المجهرية الدقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا أسلوب فعال ومباشر لتحميل وتغليف الخلايا في قطرات للتحليل الفائق، خلية واحدة وأداء الخلية التي تسيطر عليها الأقران للدراسات الخلوية التفاعل. وعلاوة على ذلك، لدينا مقارنة العديد من النهج التقليدية لتحميل خلايا لأجهزة موائع جزيئية وأظهرت أن لدينا نصيحة تحميل نهج أسلوب أكثر كفاءة مقارنة بالأساليب الأخرى.
دراسة العينات السريرية أو أنواع نادرة من الخلايا النادرة في عدد من ميكروفلويديكس على أساس الحبرية تمتلك بعض التحديات الكامنة. مثل قد أثبتنا أيضا، خلايا تميل إلى الرواسب في المحاقن وسطح الأنابيب، وبالتالي منع تغليف الخلوية لتتوافق مع القيم المتوقعة. لتجنب هذه المشكلة، استخدام بعض الجماعات أشرطة التحريك في الحقن. عند استخدام خلية نادرة ومحدودة السكان، حجم الخلية إجمالي غير أيضا محدودة، وبالتالي الحد من استخدام المحاقن الكبيرة وآثاره على أشرطة. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا استبدال الأنابيب الأكثر استخداماً مع تفلون المغلفة الأنابيب لمنع المرفقات الخلية ولكن هذا الأسلوب لم تتحسن النتائج وإذا الأنبوب طويل جداً، تفاقم مشكلة إرفاق الخلية (البيانات لا تظهر). بدلاً من ذلك، قمنا باستخدام أنبوب عمودي تحميل نهج حيث تم تحميل الخلايا في الأنبوب وليس في المحاقن الحيلولة دون فقدان الخلايا بكميات كبيرة من المحاقن. باستخدام هذا الأسلوب، خلايا ذات حجم عينة صغير يمكن تحميله، pDCs مثلاً، ونادرة ومحدودة. أيضا، يتم تحميل العينة من الأنبوب إلى الجهاز عمودياً لمنع الترسب الخلية. الأنابيب المستخدمة للخلية بذر ذات أبعاد صغيرة ويمكن مقارنة ميكروتشانيلس. تتدفق في الأنبوب الضغط مدفوعة ويتبع سرعة مكافئ الشخصية26. وهذا يعني أن سرعة تدفق الحد الأقصى في مركز الأنبوب والسرعة الحد الأدنى في حواف الأنابيب27. عند مسح أن خلايا عن طريق الأنابيب، التدرج السرعة يتسبب في الخلايا دفع نحو الحواف حيث أنها تستقر لأن السرعة في الحدود قريبة من الصفر. الترسب أو تسوية للخلايا في الأنبوب، وبالتالي يقلل من كفاءة تغليف كما هو موضح في نتائج تمثيلية حيث لا تطابق البيانات التجريبية باستخدام نموذج التنبؤ.
حل آخر تكييف شيوعاً المستخدمة من قبل العلماء، وتعمل مع ميكروفلويديكس الحبرية، زيادة كثافة وسائل الإعلام ثقافة الخلية بالإضافة لكثافة مطابقة الكواشف مثل إيوديناكسول لمنع الترسب الخلية في المحاقن19. ومع ذلك، كثافة مطابقة الكواشف يمكن أن تؤثر في سلوك الخلوية وسلبيا يؤثر على إفراز سيتوكين الخلايا (البيانات لا تظهر)28.
على الرغم من أن عدة تعديلات صغيرة وكبيرة في الخلية التقليدية تحميل تقنيات أظهرت تحسن طفيف في تغليف الكفاءة، النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها لا تزال لم تتطابق مع الحسابات النظرية. بيد مع تلميح تحميل نهج أننا يمكن في التغلب على خاضعة لقيود الأساليب السابقة والكفاءة التغليف حسب إحصاءات بواسون. هذا الأسلوب ليس فقط مفيداً لتحميل خلايا تعليق ولكن يمكن أيضا تطبيقها لتحميل خلايا ملتصقة، مثل الخلايا الكيراتينيه الأولية و A549 لرقائق موائع جزيئية. عند استخدام خطوط الخلايا وفيرة، على سبيل المثال A549، K562، و ما إلى ذلك، يمكن استخدام حجم عينة أكبر. ولذلك، تبعاً لحجم العينة، يمكن أيضا أن تستخدم ماصة الحجم مختلفة–نصائح وهذا تقنية بسيطة يمكن تكييفها لتغليف وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا التغليف.
بينما خلية منخفض التركيز مطلوب لضمان التغليف للخلايا المفردة في قطرات، المرغوب فيها تركيزات أعلى من الخلايا لزيادة متوسط عدد الخلايا مغلفة في كل قطره للدراسات المتصلة بالخلية الأقران. هناك العديد من الطرق الخلايا المفردة التي قد وصفت سابقا للخلايا المناعية زوج على رقائق موائع جزيئية أو ميكروفابريكاتيد نانوويلس29،،من3031. في ميكروفلويديكس الحبرية، يملي الإحصاءات Poisson تلك الخلية 1:1 الأقران لنوعين من خلايا مختلفة يمكن أن يتحقق بتركيزات الخلية أمثل. استناداً إلى التنبؤ بواسون، هناك أيضا احتمال أن قطرات قد تحتوي على تركيبات أخرى. بينما الأقران الخلية 1:1 يمكن أن تكون مرغوبة لدراسة التفاعلات الخلوية على مستوى الخلية الواحدة والنتائج في زيادة فهم الخلوية، الاقتران خلية متعددة أيضا مزايا رئيسية. أنها تسمح لفهم تأثير خلايا متعددة من نوع واحد من الخلايا على نوع الخلية الأخرى. عبر نقاش بين الخلايا المناعية المختلفة يساعد على توليد استجابة مناعية فعالة ضد العديد من الأمراض ومسببات الأمراض وأيضا يضيف متانة ل الجهاز المناعي لدينا32. على هذا النحو، يمكن استجوابه الاتصالات الخلوية بدقة عالية في سياقات مختلفة، مثلاً، 1:1، 2:1، 1:2، 2:2، 3:1، إلخ. فهم زيادة الغلة في كيفية واحدة أو أزواج من الخلايا التحكم تحريض الاستجابات المناعية. هذا مثير للاهتمام لا سيما لدراسة قدرة الخلايا القاتلة الطبيعية أو الخلايا cytotoxic T بقتل متسلسل على الخلايا الهدف منها على سبيل المثال.
كما تمت مناقشته، لتغليف متعددة الخلايا في قطرات، المرغوب فيها تركيزات أعلى الخلية. ومع ذلك، عند تحميل خلايا من مدخل واحد لتغليف الخلايا، يمكن أن يسبب تركيزات أعلى من عينة خلية الخلايا للتجميع في المدخل. هذه النتائج في انخفاض أسعار التغليف والانحراف أعلى من القيم النظرية. لتجنب هذه المشكلة، يمكن تحميل الخلايا من مداخل منفصلة اثنين كذلك. نظرياً، سيكون من الممكن لتطوير أجهزة موائع جزيئية أخرى مع مداخل متعددة لتحقيق مستويات أعلى لتغليف الخلايا حيث ما يبرره في متوسط على x عدد الخلايا. أننا في هذه الدراسة التحقيق في كفاءة تغليف الخلايا T جوركات عند تحميلها من مدخل واحد واثنين من مداخل استخدام نفس التركيز الكلي والحصول على كفاءة تغليف مماثل. ويسمح هذا التعديل الباحثون إلى أنواع مختلفة من الخلايا زوج على رقاقة.
بينما الإيدز هذا الأسلوب في تحميل خلايا لأجهزة موائع جزيئية دون فقدان كبير للخلايا، هناك بعض الاحتياطات التي يلزم أن يوضع في الاعتبار. عند ملء المحاقن مع الزيوت المعدنية ويسفط العينة الخلية في نصائح ماصة، وينبغي تجنب إدماج فقاعات الهواء والنظام بأكمله ينبغي أن تكون خالية من الهواء. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أنه لا ينبغي خلط الزيوت المعدنية مع العينة. ينبغي إدراج نصائح ماصة، التي تحتوي على عينات، راسخا في مداخل الجهاز موائع جزيئية، مع أقصى درجات الحيطة، لمنع التسرب، وكذلك إدماج فقاعات الهواء. وباختصار، هو تلميح-تحميل تقنية مباشرة، ومع ذلك، قوية تسمح بتحليل الفائق للسلوك الخلوية عن طريق التغليف خلية دون خسارة كبيرة للخلايا بطريقة فعالة من حيث التكلفة. عند استخدامها مع تركيزات العينة المثلى عند المدخل، هذا النهج لتحميل خلايا ماصة-نصائح مرنة جداً ويمكن تكييفها لأنواع خلايا مختلفة، خاصة بالنسبة للخلايا المناعية الأولية نادرة، للحصول على مستوى أعلى من الكفاءة التغليف، قريبة نماذج التنبؤ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر “جامعة آيندهوفن للتكنولوجيا” لدعم سخي.
Materials
| 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol | Sigma-Aldrich | 171468-5G | |
| 1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane | Fluorochem/UK | S13150 | Silane (toxic) |
| Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten | Fisher Scientific | 10630694 | Syringe |
| Biopsy Punch 1.2 mm | Harris Uni-Core | ||
| Cell Proliferation Dye eFluro 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| CellTrace Far Red Cell | Invitrogen | C34564 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendrof Tubes | Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL | |
| Glass Slide | Sigma Aldrich | CLS294775X38-72EA | Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm |
| Harvard Pumps | Harvard Apparatus | C-400750; C-400727 | Syringe pumps |
| HFE-7500 3M Novec Engineered fluid | Fluorochem/UK | 51243 | Flourinated oil |
| Kai Biopsy Punch 5 mm | Amstel Medical | 1980130 | |
| Luer stub | Instechlabs/USA | LS20S | Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile |
| Mineral oil (Light) | Sigma Aldrich | M8410-1L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Tablets |
| Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) | Sphere Fluidics | 020317-09 | Surfactant |
| Plasma Asher | Emitech | K1050X | Plasma asher |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Silicone Elastomer Base 184 | Sylgard | 9355218 | PDMS base |
| Silicone Elastomer Curing Agent | Sylgard | 9355218 | Curing Agent |
| Stainless steel catheter coupler | Instechlab/USA | SC20/15 | 20ga x 15mm, non-sterile |
| TFE Teflon Tubing | Sigma-Aldrich | 58696-U | PTFE Tubing L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in. |
| Thinky mixer ARE-250 | EX-4025F | Conditioning mixture |
References
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 110-119 (2012).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell Culture Models in Microfluidic Systems. Annual Review of Analytical Chemistry. 1, 423-429 (2008).
- Yi, C., Li, C. W., Ji, S., Yang, M. Microfluidics technology for manipulation and analysis of biological cells. Analytica Chimica Acta. 560, 1-23 (2006).
- Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
- Zhang, Y., et al. A programmable microenvironment for cellular studies via. microfluidics-generated double emulsions. Biomaterials. 34 (19), 4564-4572 (2013).
- Teh, S. -. Y., Lin, R., Hung, L. -. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Hu, H., et al. Efficient cell pairing in droplets using dual-color sorting. Lab Chip. 15 (20), 3989-3993 (2015).
- Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
- Chokkalingam, V., et al. Probing cellular heterogeneity in cytokine-secreting immune cells using droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 13 (42), 4740 (2013).
- den Haan, J. M. M., Arens, R., van Zelm, M. C. The activation of the adaptive immune system: Cross-talk between antigen-presenting cells, T cells and B cells. Immunology Letters. 162 (2), 103-112 (2014).
- Shah, G. J., Ohta, A. T., Chiou, E. P. -. Y., Wu, M. C., Kim, C. -. J. EWOD-driven droplet microfluidic device integrated with optoelectronic tweezers as an automated platform for cellular isolation and analysis. Lab on a Chip. 9 (12), 1732 (2009).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Lagus, T. P., Edd, J. F. High-throughput co-encapsulation of self-ordered cell trains: cell pair interactions in microdroplets. RSC Advances. 3, 43 (2013).
- Moon, S., Ceyhan, E., Gurkan, U. A., Demirci, U. Statistical modeling of single target cell encapsulation. PLoS ONE. 6 (7), (2011).
- Abate, A. R., Chen, C. -. H., Agresti, J. J., Weitz, D. A. Beating Poisson encapsulation statistics using close-packed ordering. Lab on a Chip. 9 (18), 2628 (2009).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. -. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Kemna, E. W. M., et al. High-yield cell ordering and deterministic cell-in-droplet encapsulation using Dean flow in a curved microchannel. Lab on a Chip. 12 (16), 2881 (2012).
- Köster, S., et al. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a Chip. 8 (7), 1110 (2008).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Sun, P., et al. Functional characterization of ex vivo. blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells after infection with dengue virus. Virology. 383 (2), 207-215 (2009).
- Tel, J., et al. The chemotherapeutic drug oxaliplatin differentially affects blood DC function dependent on environmental cues. Cancer Immunology, Immunotherapy. 61 (7), 1101-1111 (2012).
- Wimmers, F., et al. Single-cell analysis reveals that stochasticity and paracrine signaling control interferon-alpha production by plasmacytoid dendritic cells. Nature Communications. 9 (1), 3317 (2018).
- Gong, J., Kim, C. -. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab on a Chip. 8 (6), 898 (2008).
- Demirci, U., Montesano, G. Single cell epitaxy by acoustic picolitre droplets. Lab on a Chip. 7 (9), 1139 (2007).
- Rho, H. S., Yang, Y., Veltkamp, H. -. W., Gardeniers, H. Direct Delivery of Reagents from a Pipette Tip to a PDMS Microfluidic Device. Chips and Tips. , (2015).
- Paul, P. H., Garguilo, M. G., Rakestraw, D. J. Imaging of Pressure- And Electrokinetically Driven Flows through Open Capillaries. Analytical Chemistry. 70 (13), 2459-2467 (1998).
- Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. 54, 42 (2001).
- Mita, A., et al. Anti-proinflammatory Effects of Iodixanol (OptiPrep)-Based Density Gradient Purification on Human Islet Preparations. Cell Transplant. 19 (12), 1537-1546 (2013).
- Dura, B., et al. Profiling lymphocyte interactions at the single-cell level by microfluidic cell pairing. Nature Communications. 6 (1), 1-13 (2015).
- Dura, B., et al. Longitudinal multiparameter assay of lymphocyte interactions from onset by microfluidic cell pairing and culture. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3599-3608 (2016).
- Yamanaka, Y. J., et al. Single-cell analysis of the dynamics and functional outcomes of interactions between human natural killer cells and target cells. Integrative Biology. 4 (10), 1175 (2012).
- Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: From populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
