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工程学

피 펫 팁 드롭릿 미세 플랫폼 시드 셀에 대 한 메서드를 기반으로

Published: February 11, 2019
doi:
10.3791/57848
, , , ,
1Department of Biomedical Engineering and Institute for Complex Molecular Systems, Laboratory of Immunoengineering,Eindhoven University of Technology, 2Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Beckman Center,Stanford University

Summary

이 문서 시드 방울에 세포의 캡슐화 능률을 제공 하기 위해 물방울 미세 장치에 피 펫 팁을 사용 하 여 셀의 부족 한 인구를 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Abstract

다양 한 미세 플랫폼 디자인 세포 분석에 자주 사용 되, 사이 방울-마이크로 분리 하 고 세포에 외부 요인의 영향을 제거 하 여 세포를 단일 세포 수준에서 분석 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다. microenvironment입니다. 방울에 세포의 캡슐화는 각 방울에 존재 하는 셀의 수와 물방울의 부피 당 세포의 평균 수의 함수로 포아송 분포값에 의해 결정 됩니다. 1 차 셀, 특히 면역 세포, 또는 임상 표본 부족 수 있으며 셀의 무손실 캡슐화 유지 도전. 이 문서에서 우리는 로드 셀 셀의 상당한 손실 없이 미세 물방울 기반 장치에에 피 펫 팁을 사용 하는 새로운 방법론 제시. 다양 한 세포 유형으로 밀접 하 게 캡슐화 효율 포아송 분포에 의해 예측에 해당 하는 물방울에 효율적인 셀 캡슐화를 설명 합니다. 우리의 방법은 미세 플랫폼 셀의 무손실 로드를 보장 하 고 다운스트림 단일 세포 분석, 예를 들어, 다른 세포 유형 사이 세포 상호 작용 해독을 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.

Introduction

최근 몇 년 동안, 단일 세포 수준에서 세포 분석을 위한 강력 하 고 다양 한 플랫폼으로 마이크로의 사용 급속 하 게 증가1있다. 이러한 플랫폼 단일 세포 및 높은 정밀도와 감도 매우 작은 샘플 볼륨2,,34를 사용 하 여 생물학 분자의 높은 처리량 검열을 제공 합니다. 미세 디자인의 다른 종류 중에서 물방울 기반 플랫폼 세포 정확 하 고 정확한 통제를 허용 하는 혼합할 수 없는 단계에 의해 포위 하는 수성 단계 물방울에서 그들을 분리 하 여 단일 셀의 높은 처리량 분석을 사용 microenvironment5,6. 드롭릿 기반 마이크로 제공 유연성을 단일 또는 다중 셀에, 둘 다, 수성 및 히드로 방울 고 단백질 분 비 또는 세포질 상호 작용7, 등의 복잡 한 세포 동작을 프로 빙에 가치가 있다 8 , 9. 신호 및 면역 세포 사이 잡담 microenvironment10에 있는 다른 세포와의 상호 작용에 의해 좌우 될 수 있다. 방울에 단일 셀의 절연 효과적인 잡음이 분석 실험실을, 더 효율적이 고 정확한 결과11,12에 대 한 외부 환경 요인의 영향에서 무료 제공합니다. 여러 종류의 세포 세포 상호 작용을 통해 셀 페어링12,13공부 캡슐화 가능 여러 후미와 물방울 미세 플랫폼의 디자인 수정

방울에 세포의 캡슐화 과정 무작위 이며 포아송 분포14,15에 대 한 수식을 사용 하 여 세포의 캡슐화의 속도 통계적으로 결정 될 수 있다. 캡슐화의이 속도 방울에 셀의 도착의 평균 속도 고려 하 여 예상할 수 있는 그리고 각 셀의 도착의 도착에서 독립 된 세포16. 독립적인 셀 도착을 보장할 수 없습니다, 비록 띄엄띄엄 분산된 셀의 경우, 독립의 가정으로 간주 될 수 있습니다. 및 셀의 수의 기능으로 하나 이상의 셀을 포함 하는 작은 물방울의 확률을 예측할 수 있습니다. 각 방울 방울16,17당 세포의 평균 수에 존재. 하나는 입구에서 세포의 농도 증가 셀 각 방울 에 평균 수를 늘릴 것 이라고 하는 것을 건의 할 수 있다 방울 세포 캡슐화의이 추정이 각 방울에 존재 하는 셀의 수에 따라 이기 때문에, 16. 따라서, 단일 세포 캡슐화를 위해 셀 농도 감소 되어야 한다 이것은 종종 단서 하지만 빈 물방울18의 다 수.

첨부 파일, 침전, 또는 주사기에 응집, 튜브, 또는 생산 장치에 의해 로드 하는 동안 세포의 손실은 일반적인 단점 예측된 캡슐화 값19 에서 실제 캡슐화 값의 편차에 대 한 책임 . 이 문제는 때 그들은 이미 인구에 부족 하 고 몇 가지 셀만, 훨씬 더 낮은의 캡슐화 예상 보다 제공 하지 않습니다 충분 한 데이터 실험 분석에 대 한 희귀 면역 세포 또는 임상 표본 시드 과장 더 가져옵니다. Plasmacytoid 수지상 세포 (pDCs)만 구성 하는 면역 세포의 드문 하위 집합은 약 0.2-0.6%의 전체 화이트 혈액 세포 인구20. 이 세포의 대량 분 비 interferons 활성화 유형 I와 함으로써 면역 반응21에 중요 한 역할. 방울 같은 희귀 세포의 세포질 행동 공부, 시드 셀 및 캡슐화22동안 세포 손실을 방지 하기 위해 필수적입니다. 몇 방울 방울 포함의 세대에 대 한 음향 또는 전기 힘과 같은 다른 물리적 힘을 활용 하는 적극적인 캡슐화 방법을 사용 하 여 단일 셀의 캡슐화 보장 관련된 개발 디자인 있다 단일 셀23,24. 그러나, 이러한 방법은 방울 생산16측면에서 그들의 자신의 한계를 가진다.

이 연구에서 우리는 강력 하 고 간단한 메서드를 circumvents 미세 장치 하나 또는 여러 개의 셀을 로드 하기 위한 전통적인 방법의 단점 설립. 우리의 노 외.에 의해 영감을 중요 한 샘플 손실 없이 물방울 미세 플랫폼 희귀 면역 세포의 작은 볼륨을 시드를 위한 다르게 크기의 피 펫 팁을 활용 하 여 메서드와 이론적으로 일관 된 결과 굴복 예측25. 이 방법론 쉽게 될 수 있습니다 및 성공적으로 하 게 물방울 기반 마이크로 관련 된 여러 응용 프로그램에 대 한 적응 하 고 다양 한 세포 유형 또는 심지어 미에 대 한 적용.

Protocol

1. 3-입구입니다 (PDMS) 장치 제조 컨디셔닝 믹서에서 PDMS 자료의 40 g을 측정 컵 및 추가 PDMS 경화제 4 g 컵에서 기본 시 약을 신중 하 게, dropper를 사용 하 여. 컨디셔닝 믹서의 소유자에 컵을 놓고 보유자와 컵의 총 무게를 측정 합니다. 컨디셔닝 믹서에 따라 원심 분리기 균형 무게의 가치를 설정 합니다. 2 분 뒤에 2 분 2000 rpm에서 거품 드 2000 rpm 조절 믹서에 기본 및 경화 에이전트 믹스. 약 100 m m 실리콘 웨이퍼의 동일한 크기 직경 알루미늄 보트를 준비 합니다. 성형 과정, 알루미늄 보트에서 복제본에 대 한 조작 실리콘 웨이퍼를 놓고 배양 접시에서이 설치를 넣어 (직경 120 m m, 높이 = = 20 m m).참고: 페 트리 접시의 크기는 실리콘 웨이퍼의 크기에 따라 다릅니다. 컵 홀더를 제거 하 고 실리콘 웨이퍼에 신중 하 게, 미리 치료 PDMS 혼합물 (잔을의 내용)를 부 어. 모든 기포를 제거 하는 약 20 분 동안 desiccator에서 미리 치료 PDMS 혼합물과 실리콘 웨이퍼를 포함 하는 배양 접시를 놓습니다. 20 분 후에 제거 될 수 있는 모든 나머지 기포 확인 페 트리 접시를 제거 합니다. 오븐, 65 ° C, 3 h 이상에서 설정에 페 트리 접시를 놓습니다. 3 h 후 페 트리 접시는 오븐에서 제거 하 고 실리콘 웨이퍼에서 치료 PDMS를 신중 하 게 껍질. 칼 이나 메스를 사용 하 여 커트 라인을 따라 잘라 PDMS 장치. 후미와 1.2 m m 구멍을 뚫는 사용 하 여 각 장치의 콘센트에 구멍을 펀치. PDMS의 어떤 먼지 또는 잔여 조각을 제거를 스카치 테이프로 각 PDMS 장치를 청소 하십시오. 선택적으로, 잔여 PDMS 조각을 제거 하는 질소로 불어. 소 프로 파 놀와 질소 건조 비누 물으로 청소 하 여 유리 슬라이드를 준비 합니다. 깨끗 한 PDMS 장치는 플라즈마에 깨끗 한 유리 슬라이드와 함께 본드를 닫습니다 흐름 라인 아 셀. 다음 설정을 사용 하 여: 전력: 50 W, 시간: 45 s, 도련 지연 시간: 2 s, 공정 가스: 가스 1 (공기), 환기: 두 밸브, 제한 된 환기 시간: 60 s, 펌프 스핀 다운 시간: 10 s, 환기 유지 시간: 0 s, 가스 차단 시간: 1 s, 터보 펌프 사용 : 0. 다른 모든 가스 라인을 분리.참고: 플라즈마 애 셔는 플라즈마의 브랜드에 따라 다를 수 있습니다 사용 되는 설정 아 셀 사용. 준비 실 란 솔루션 silane (1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 H-Perfluorooctyltriethoxysilane)의 50 µ L을 추가 하 여 플 루 오 르의 950 µ L 오일.참고: Silane 독성이 있다. 증기 두건에서 운영 하십시오. 테 플 론 튜브에 연결 되어 있는 주사기에 준비 실 란 솔루션을 그립니다. 장치의 콘센트를 통해 준비 실 란 솔루션을 홍 조 하 여 장치를 salinize. 오븐, 65 ° C, 30 분에서 설정에 장치를 넣습니다. 오븐에서 salinized 장치를 제거 하 고 장치에서 초과 silane 불 기름으로 플러시. 65 ° C, 접합 과정을 완료 하려면 적어도 1 시간에서 설정, 오븐에 다시 장치를 놓습니다.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 2. 무손실 셀 캡슐화 셀 수확 다시 1.0×106 셀/mL, 2.0×106 셀/mL, 4.0×106 셀/mL, 및 8.0×106 셀/mL;의 농도에서 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에 Jurkat T 세포를 일시 중단 조 혈 혈 청 무료 문화 미디어 (예: X-VIVO 15) 1.3×106 셀/mL, 3.0×106 셀/mL, 및 13.0×106 셀/mL;의 농도에서 Pdc A549 세포에 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 1.0×106 셀/mL의 농도에서.참고: 셀과 셀의 농도의 형식 실험에 따라 달라질 수 있습니다. 셀 라벨도 할 수 있습니다 실험에 따라. 수성 작은 물방울 생성에 대 한 팁-로드 계면 활성 제의 3 mL 불 오일의 2 개 mL를 추가 하 여 불 오일 3% 생체 계면 활성 제 혼합물을 준비 합니다.참고: 불 기름에 추가 계면 활성 제의 농도 다른 인큐베이션 기간 동안 유제의 안정성을 결정 합니다. 계면 활성 제의 농도 특정 셀 형식에 사용 하는 미디어에 따라 다릅니다. 주사기 (1 mL) 오일 위상 혼합물을 그립니다. 주사기에서 공기 방울을 제거 하 고 적절 한 길이의 테 플 론 튜브에 연결. 주사기에 드로잉 생체 미네랄 오일에 의해 샘플 주사기를 준비 합니다. 기포를 제거 하 고 적절 한 길이의 테 플 론 튜브에 주사기를 연결. 치료 PDMS 슬 래 브에서 5 mm의 직경을 가진 PDMS 플러그를 펀치.참고: 치료 PDMS 슬 래 브 수 준비 단계 1.1 1.9를 사용 하 여. 일반 실리콘 웨이퍼를 사용 하 여 날조 된 실리콘 웨이퍼 대신. 1mm 구멍을 뚫는와 플러그의 센터에 또 다른 구멍을 펀치. 그것은 밀접 하 게 맞는 그런 큰 끝에서 200 µ L 피 펫 팁, 플러그를 삽입 합니다.참고: 큰 샘플 볼륨을 더 큰 세포 1000 µ L 피 펫 팁을 사용 합니다. 1000 µ L 피 펫 팁, 5 m m와 7 m m 사이 배열 하는 직경의 플러그를 사용할 수 있습니다. 직경 5 m m, 약 400의 샘플 볼륨의 플러그와 µ L 피 펫 팁에서 발음 될 수 있다. 더 큰 직경의 플러그 사용된 (7mm) 인 경우에, 더 많은 샘플 볼륨 (약 900 µ L) 발음 수 있습니다. 피 펫 팁에 삽입 된 PDMS 플러그에는 주사기에 연결 된 튜브를 삽입 합니다. 미네랄 오일 연결 된 피 펫 팁을 천천히 주사기 플런저를 밀어. 피 펫 팁에서 모든 잔여 공기를 밖으로 밀어. 낮은 피 펫 팁, 샘플 솔루션에 주사기를 연결 하 고 약 150 µ L에 있는 샘플의 발음. 2.2.4에 2.2.8 두 번째 샘플 주사기를 준비 단계 반복 합니다. 신중 하 게 모든 3 개의 준비 된 주사기 주사기 펌프 장소. 두 피 펫 팁, PDMS 칩의 2 개의 내부 후미에서 샘플 포함을 삽입 합니다. 외부 입구에 오일 위상 혼합물을 포함 하는 튜브를 삽입 합니다. 주사기 펌프에 흐름 율의 값을 다음과 같이 설정: 연속 단계 솔루션: 600 µ L/h, 셀 샘플: 100 µ L/h, 각각. 입력 하 고 주사기의 크기를 설정 합니다.참고: 설정이 달라 집니다 직경 주사기의 유형을 기반으로 합니다. 장치의 외부 채널을 통해 장치 및 오일 단계의 내부 채널을 통해 샘플 솔루션을 펌프를 시작 합니다. 방울 방울 형성은 안정 때 수집 시작 콘센트에 적절 한 길이의 튜브에 연결 합니다. 컬렉션의 시간 실험에 따라 다릅니다. 잠금 튜브에 방울을 수집 합니다. 수집 된 방울 위에 (혈 청) 없이 RPMI 매체의 200 µ L을 추가 하 고 샘플을 품 어.: 보육 수집된 방울의 시간 변화에 따라 실험. 방울 흐름 cytometry 기반 분석 또는 격리 유제를 끊어서 작은 물방울에서 셀을 검색 한 후 수행 하는 경우 잠금 튜브에 수집 됩니다. 실험에서 물방울 현미경 분석 해야 하는 경우 유리 챔버에 물방울을 수집 가능 하다. 에멀젼과 셀 흐름 cytometric 분석을 위한 검색 20%를 준비 1 시간, 1 시간, 2 시간, 2 시간-퍼플-1-octanol (PFO) 솔루션 (v/v) flourinated 기름의 10 mL에서 PFO의 2 개 mL를 추가 하 여 불 기름에. 주사기를 사용 하 여 작은 물방울을 포함 하는 컬렉션 튜브의 아래쪽에서 초과 석유를 제거 합니다. 유제 휴식과 수성 단계에 캡슐화 된 셀을 해제 유제를 20 %PFO 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 버튼을 누르고 잠시 혼합. 이 시점에서 소용돌이 하지 마십시오. 1-2 분 동안 품 어.참고: 추가 PFO의 양을 생산 하는 작은 물방울의 수량에 따라 달라 집니다. 기름 층은 완전히 해산 될 때까지 계속 추가 PFO 추가. PFO이 있는 셀에 대 한 독성과 세포 죽음 증가 너무 높은 PFO 농도 또는 PFO 너무 긴 인큐베이션 이어질 수도 명심에서 하십시오. 회전 30에 대 한 가장 낮은 가능한 rcf에 곧 솔루션 s. 100 mL 찬 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 솔루션 2% 보완 준비 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 98 ml PBS의 FCS (2 mL). 원심 분리 후 즉시 수성 분수의 550 µ L 플라스틱 하 고 준비 단계 2.3.5에서에서 차가운 PBS 솔루션 2 S 보충의 500 µ L를 포함 하는 새로운 잠금 튜브에 그것을 전송. 어떤 잔여 기름 하자 새로운 잠금 튜브의 바닥에 싱크. 어떤 잔여 기름 발음 하지 않고 신중 하 게,이 잠금 튜브에서 세포를 포함 하는 수성 단계의 950 µ L 발음 하 고 새로운 잠금 튜브에 솔루션을 전송. 10 분에 대 한 새로운 잠금 튜브에 셀 아래로 회전 합니다. 2.3.5 단계에서 준비 다시 차가운 PBS 솔루션 2 S 보충의 300 µ L에 셀을 일시 중단 합니다.참고: 셀 수 또한 다시 일시 중지 미디어 실험에 따라 다른 적합 한 솔루션. 셀, cytometry 사용 하 여 분석용 실험에 따라 얼룩. 3. 셀 페어링 셀 수확 및 얼룩 Jurkat T 세포, 문화 플라스 크, 고 5 분 동안 1500 rpm에서 셀 아래로 회전. 상쾌한을 제거 하 고 다시 1 mL 1.0×106 셀/mL의 농도를 PBS에서에서 1.0×106 셀을 일시 중단 합니다. 추가 PBS 세포 수에 따라 다릅니다. 3.1.1 3.1.2에 동일한 셀 농도 Jurkat T 세포의 두 번째 샘플을 준비 하 단계 반복 합니다. 5 분 동안 1500 rpm에서 PBS의 1 mL로 두 번 모두 샘플을 씻으십시오. 다시 일시 중단 1.25 µ M carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 염료와 하나 셀 샘플 및 1.25 µ M까지 붉은 염료 또는 1.25 µ M 세포 확산 염료 다른 셀 샘플 셀 1.0×106 셀/mL의 농도에. 얼룩이 솔루션 총 1.0×106 셀 1 mL 이다.참고: 셀 필터 형광 현미경 또는 교류 cytometer에서 사용할 수에 따라 다른 염료 이라는 수 있습니다. 37 ° c.에서 10 분 동안 염료 셀 샘플을 품 어 10 분 후 얼음 차가운 FCS의 1 mL을 추가 하 여 착 색 반응을 중지 합니다. 5 분 동안 1500 rpm에서 PBS의 1 mL로 두 번 셀 샘플을 씻으십시오. 다시 RPMI 미디어 10.0×106 셀/mL, 각 색상의 농도에서 세포 샘플을 일시 중단 합니다. 팁-로드 셀 쌍에 대 한 agarose 히드로 방울의 생산을 위한참고: 페어링 agarose 히드로 방울을 사용 하 여 셀에 대 한 시스템은 hydrogels의 고를 방지 하 고 세포 생존 능력9영장 물방울 생성 및 수집 과정에서 37 ° C와 27 ° C의 온도 유지. 그것은 최대 75 ° C PBS에서 4% (w/v)의 농도에 열 하 여 매우 낮은 고 온도 agarose를 녹이 고 20 분을 위한 혼합물을 저 어. 2% (w/v)의 agarose 농도를 셀 이라는 Jurkat t agarose 솔루션을 믹스. 다르게 이라는 세포와 다른 샘플에 대 한이 반복 합니다. 계면 활성 제의 20 mL 30 mL 불 기름 (오일 단계 혼합물)에 추가 하 여 불 오일 2% 계면 활성 제 혼합물을 준비 합니다. 2.2.2-2.2.14 단계를 따릅니다.참고: 낮은 녹는 agarose의 고 안정 방울 생산 점성 특성, 흐름 율의 값 주사기 펌프에 다음과 같이 설정: 단계 혼합 오일: 2000 µ L/h, 셀 샘플: 200 µ L/h. 입력 하 고 주사기의 크기를 설정. 잠금 튜브에 방울을 수집 하 고 60 분 동안 4 ° C에서 물방울을 품 어. 이멀전 속보 및 FACS 분석을 위한 agarose 구슬 검색 60 분에 대 한 방울의 부 화, 후 주사기를 사용 하 여 작은 물방울을 포함 하는 잠금 튜브에서 초과 석유를 제거 합니다. 작은 물방울에서 오일 interphase를 제거 하려면 PFO의 200 µ L를 추가 합니다.참고: 튜브에 추가 PFO의 양을 생산 하는 작은 물방울의 수량에 따라 달라 집니다. 기름 층은 완전히 해산 될 때까지 계속 추가 PFO 추가. 수집 된 agarose 구슬 10 분 1500 rpm에서 원심 분리 하 여 석유를 완전히 제거 하려면 차가운 PBS의 1 mL로 두 번 씻는 다. 수집된 agarose 구슬 cytometry 사용 하 여 분석 합니다.참고: 그것은 또한 형광 현미경 구슬 관찰 가능입니다.

Representative Results

우리의 실험 3-입구 PDMS 기반된 미세 장치 25 미크론 (그림 1)의 높이를 사용 했습니다. 이 장치 설치, 우리 셀 정지 또는 미디어 수성 단계를 홍 조에 대 한 계면 활성 제와 두 개의 내부 후미 오일 홍 조에 대 한 외부 입구를 사용 합니다. 세대 수집 후에, 작은 물방울 cytometry 흐름 사용 하는 다운스트림 분석 하기 전에 몇 시간 칩에서 incubated는. 인큐베이션 기간 동안 혈 청 구성 요소는 미디어에는 계면 활성 제와 상호 작용 하 고 불안정 하 고 분해 하는 방울을 발생할 수 있습니다. 그러므로 계면 활성 제에의 한 최적화 된 농도 불 기름에 추가 중요 하다. 우리 조 혈 혈 청 무료 문화 미디어 불 기름에 계면 활성 제의 다른 농도가 2% 인간의 혈 청으로 보충을 포함 하는 monodispersed 작은 물방울의 안정성을 테스트. 그것은 추정 될 수 있다 그림 2 는 이러한 monodispersed 방울은 매우 때 적어도 24 시간 동안 안정적인 3% 계면 활성 제는 단계에 추가 오일. 비슷한 결과 RPMI 미디어와 10 S (데이터 표시 되지 않음)의 추가 없이 얻은 했다. 문화 미디어와 혈 청 성분의 다른 소스와 함께 작업 하는 경우 따라서, 드롭릿 안정성 매우 최적의 계면 활성 제 농도에 따라 달라 집니다. 우리의 접근 방법의 캡슐화 효율을 보여 주기 위해 우리는 먼저는 시드 셀(그림 3)에 대 한 가장 전통적인 방법은 주사기에 연결 하는 튜브를 사용 하 여 셀 시드. 우리 1.0×106 셀/mL, 2.0×106 셀/mL, 및 4.0×106 셀/mL의 다른 농도에서 Jurkat T 세포가을 걷이 그리고 캡슐화 효율성을 예측된 값 (그림 3B) 보다 낮 았다. 1.0×106 셀/mL, 단일 셀에 포함 된 물방울의 분수 2.5%, 더 높은 세포 농도 사용 하 여 시도 증가 하지 않았다 했다. 효율성을 증가 하는 세포-로드, 우리 우리의 이전 방식을 수정 높은 삼각대를 절반 길이에 튜빙을 장착 하 고 PDMS 장치(그림 4)에 붙어 있던 절반에서 세포 현 탁 액을 로드. 이 방법을 사용 하 여, 우리 1.0×106 셀/mL, 2.0×106 셀/mL, 및 4.0×106 셀/mL의 다른 농도에서 Jurkat T 세포 그리고 또한 1.0×106 셀/mL의 다른 농도에서 드문 Pdc 캡슐화 2.0×106 셀/mL, 그리고 12.0×106 셀/mL. 우리는이 방법으로 세포 침전을 방지 하 여 향상 된 캡슐화 요금을 예상. 그러나, 농도 테스트에서 실험 결과 예측된 포아송 값 (그림 4B 및 그림 4C) 훨씬 낮은 했다. 우리 통계 예측된 값(그림 5)와 일관 된 실험 결과 얻기 위해 우리의 세포 캡슐화 속도 최적화 팁-로드 접근을 사용 하 여. Jurkat T 세포의 다른 농도 대 한 획득된 캡슐화 효율 모든 농도 (그림 5B)에서 우리의 계산 된 값을 일치합니다. 놀랍게도, 함께 덩어리 하는 경향이, A549 종양 세포와 같은 부착 세포 1.0×106 셀/mL (그림 5C)의 세포 농도에서 약간 향상 된 캡슐화 효율을 관찰 합니다. 우리는 또한 우리의 시스템을 덜 사용 가능 하 고 부족 한 다른 셀 농도 1.0×106 셀/mL, 3.0×106 셀/mL, 및 13.0×106 셀/mL (그림 5D)에서 Pdc를 캡슐화의 효능 평가. 촉진 하기 위해 200 µ L를 초과 하는 가능성이 더 큰 볼륨의 로딩, 예를 들어, 셀 라인 또는 더 풍부한 기본 면역 세포, 작업할 때 우리 또한 조사 셀 캡슐화 효율성 1000 µ L 팁 (파란색)를 사용 하 여. 우리는 이러한 1000 µ L 팁 준 200 µ L 팁 (노랑) (그림 5E)에 비해 비슷한 캡슐화 효율을 설명 했다. 칩 설계 및 연구 질문에 의존, 우리의 팁 기술 로드 로드 세포질이에 프로 빙에 대 한 하나의 입구 또는 디코딩 세포 상호 작용에 대 한 동시에 여러 개의 후미를 통해 셀을 사용할 수 있습니다. 우리 한 입구에서 (10.0×106 셀/mL의 농도)에 Jurkat T 세포의 2 개의 다르게 이라는 인구에 Jurkat T 세포의 로딩 비교 (10.0 결합된 농도에서 x106 셀/mL) 2 개의 후미 (그림 6 에서 A 및 그림 6B). 캡슐화, 동안 작은 물방울 초 저 고 온도 agarose를 사용 하 여 및 후속 다운스트림 분석 통해 현미경 및 흐름 cytometry (그림 6 허용 양식 agarose 히드로 구슬 생산 후 gelled 생성 된 C 와 그림 6D). 현미경 분석을 페어링 (그림 6C) 높은 처리량 셀 나타내는 다른 조합에서 달성 했다 셀 쌍을 밝혔다. 또한, cytometry에 의해 히드로 구슬의 동일한 인구의 분석 셀 뚜렷한 앞으로 (FSC, 크기)에 따라 sideward (SSC, 세분성) 셀 없이 구슬 구슬에서 분리 될 수 있었다 공개 분산형 패턴 (그림 6 D). 셀 없이 구슬의 인구에 게이팅 형광 신호의 부재에 의해 세포 캡슐화의 부족을 확인 했다. 또한, 세포와 구슬 인구에 게이팅 다르게 레이블이 Jurkat T 세포의 캡슐화에 대 한 여러 하위 인구 지표의 존재를 밝혔다. 우리의 결과 효율적인 셀 쌍 달성 될 수 있다, 모두 미세한 기반와 cytometric 분석, 흐름과 푸아송 예측 (그림 6E)에 비해 약간 증가 캡슐화 효율을 보여 보여 줍니다. 그림 1 . 3 개의 후미와 1 개의 출구 PDMS 기반으로 작은 물방울 미세 장치. 장치 구성 됩니다 3 후미의 지속적인 오일 단계, 세포 배양 및 세포 현 탁 액, 각각. 생성 된 물방울은 콘센트에서 수집 됩니다. 샘플 흐름 laminarly 흐름 초점 연결 어디 그들은 작은 물방울에 캡슐화 됩니다. 후미에서 필터 구조 단백질 같은 큰 입자를 개최 또는 셀 집계. 필터 구조에 간격의 직경은 파란색 라인으로 표시 됩니다. 생산 노즐에서 채널의 직경 빨간색 선으로 표시 됩니다. 전체 칩에 채널 높이 있었다 25 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 . 드롭릿 안정성 24 시간 이상. 3 다른 농도의 계면 활성 제에 대 한 시간이 지남에 조 혈 혈 청 무료 문화 미디어 + 2% 인간 혈 청를 포함 하는 작은 물방울의 영역을 표시 하는 그래프 A) 0.5% B) 3% C) 5%. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 . 튜빙 접근을 로드 셀을 기반으로 합니다. Jurkat T 세포 튜브에 연결 하는 주사기를 사용 하 여 장치를 서로 다른 농도에서 로드 됩니다. A) 그림과 실험 설치 B) 셀 캡슐화 속도 가벼운 현미경 검사 법에 의해 결정 된 대로. 점: 실험적으로 결정 값; 라인을 폐쇄: 포아송 분포. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 . 다양 한 종류의 세포 접근 로드 수직 튜브를 사용 하 여 다른 농도에서 캡슐화. Jurkat T 세포와 (다른 농도)의 Pdc 셀 캡슐화의 효율성을 결정 하기 위해 캡슐 했다. A) 그림과 수직 튜브 로드 하는 방법에 대 한 실험 설정. B) 그래프 표시 캡슐화 효율 Jurkat T 세포. C) 그래프는 Pdc의 캡슐화 효율을 보여 줍니다. 점: 실험적으로 결정 값; 라인을 폐쇄: 포아송 분포. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 . 다른 셀 형식을 캡슐화 하 접근 로드 팁. A) 기술 로드 팁의 구조 그림. B) 그래프 Jurkat 세포의 캡슐화 효율을 보여줍니다. C) 그래프 A549 세포의 캡슐화 효율을 보여줍니다. D) 그래프는 Pdc의 캡슐화 효율을 보여 줍니다. E) 는 그래프로 Jurkat T의 캡슐화 효율 200 µ L 피 펫 팁 (노란색) 및 1000 µ L 피 펫 팁 (블루)를 사용 하 여 셀. 점: 실험적으로 결정 값; 라인을 폐쇄: 포아송 분포. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6 . 방울에 페어링 하는 셀입니다. A) 쌍 방울 2 후미에서 개별 셀에 대 한 접근을 로드 팁의 구조 그림. B) 는 그래프로 Jurkat T의 캡슐화 한 입구 또는 병렬로 두 후미를 사용 하 여 셀. 한 팁에 대 한 셀 농도 2.0×106 셀/mL 이며 2 셀 집중 팁 두 1.0×106 셀/mL. 점: 실험적으로 결정 값; 라인을 폐쇄: 포아송 분포. C) 는 형광 현미경 오버레이 히드로 구슬과 이라는 Jurkat T 세포의. D) 그래프는 agarose 히드로 구슬에 짝된 셀의 흐름 cytometric 분석을 보여 줍니다. 줄거리는 모두 앞으로 분산형 및 측면 분산형 보여 줍니다. E) agarose 히드로에서 핸드폰 번호의 비교 비즈 형광 현미경 검사 법 및 흐름 cytometry에 의해 감지. 바: 의미 값; 수염: 그러니까, n ≥ 4의 표준 오류입니다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 로드 셀 높은 처리량, 단일 세포 분석용 방울에 캡슐화 하 고 통제 세포 세포 상호 작용 연구에 대 한 연결을 수행 하는 효율적이 고 간단한 기법을 증명 하고있다. 또한, 우리 로드 셀 미세 장치를 몇 가지 기존의 방법을 비교 하 고 접근을 로드 하는 우리의 끝 다른 방법에 비해 더 효율적인 기술 이다 보여주었다.

공부 임상 표본 또는 희귀 세포 유형 드롭릿 기반 마이크로 수에 부족 한 몇 가지 고유의 과제를 소유한 다. 처럼 우리는 또한 증명 하고있다, 셀 하는 경향이 주사기와 튜브의 표면에 퇴적, 예측된 값에 맞게 세포 캡슐화를 방지. 이 문제를 피하기 위해, 일부 그룹은 주사기에 교 반 막대를 사용 합니다. 그러나, 희귀 하 고 제한 된 세포 인구를 사용할 경우 요약 셀 볼륨도 제한 됩니다, 따라서, 큰 주사기의 사용을 제한 하 고 교 반 바. 또한, 우리 또한 테플론으로 코팅 셀 첨부 파일을 방지 하기 위해 튜브와 더 일반적으로 사용 되는 튜브를 교체 하지만이 메서드는 결과 개량 하지 않았다 고 튜브 너무 긴 경우 셀 첨부 파일 문제 악화 (데이터 표시 되지 않음). 또는, 우리 큰 주사기 볼륨에서 셀의 손실을 방지 하기 위해 주사기에 튜브에 셀 로드 어디 수직 튜브 로딩 방식을 사용. 이 기술을 사용 하 여, 작은 샘플 볼륨 셀 로드할 수 있습니다, 예를 들어, Pdc는 희귀 하 고 제한. 또한, 튜브에서 샘플 셀 침전을 방지 하기 위해 수직으로 장치에 로드 됩니다. 시드 셀 사용 하는 튜브 작은 크기 있으며 microchannels 비교 될 수 있다. 튜브에서 흐름 압력 중심 이며 포물선 속도 프로 파일26. 최대 흐름 속도 배관의 중심에는 및 최소 속도 튜브27의 가장자리에는 의미 합니다. 튜브를 통해 세포의 인구 홍 조, 속도 그라데이션 경계에서 속도가 0에 가까이 있기 때문에 그들은 진정 어디 가장자리 쪽으로 밀어 세포 발생 합니다. 침전 또는 셀에 튜브에서의 정착, 실험 데이터 예측 모델과 일치 하지 않는 대표적인 결과 같이 캡슐화 효율 감소.

드롭릿 마이크로 함께 일 하는 과학자 들에 의해 사용 되는 다른 일반적으로 적응된 솔루션 밀도 일치 하는 주사기19셀 침전을 방지 하기 위해 Iodinaxol와 같은 시 약의 추가 의해 세포 배양의 밀도 증가 하는. 그러나, 일치 하는 시 약 밀도 세포 행동 영향을 미칠 수 및 부정적인 cytokine 분 비 영향으로 세포가 (데이터 표시 되지 않음)28.

기존의 셀 기술 로드에 여러 크고 작은 수정 캡슐화 효율성에 약간의 개선을 보였다, 비록 획득된 실험 결과 여전히 않았다 일치 하지 이론적인 계산. 그러나, 접근을 로드 팁 우리는 극복 이전 메서드 및 캡슐화 효율의 한계 제어 포아송 통계 수 있습니다. 이 기술은 뿐만 아니라 현 탁 액 셀 로드에 유리 하지만 기본 keratinocytes 등 A549 미세 칩을 부착 셀 로드 되었을 수도 있습니다. 풍부한 셀 라인, 예를 들면 A549, K562, 등, 사용 하는 경우 더 큰 샘플 볼륨을 사용할 수 있습니다. 따라서, 샘플의 볼륨에 따라 다른 크기의 피 펫 팁을 사용할 수 있습니다 그리고이 간단한 기술은 단일 셀 캡슐화 및 여러 셀 캡슐화에 대 한 적용할 수 있습니다.

동안 낮은 셀 농도 방울에서 단일 세포의 캡슐화 확인 하는 데 필요한, 더 높은 세포 농도 셀 쌍에 관련 된 연구에 대 한 각 방울에 셀의 평균 수를 늘리기 위해 원하는. 이전에 미세 칩 또는 ﹙ nanowells29,,3031쌍 면역 세포를 설명 하는 여러 단일 셀 방법이 있다. 드롭릿 마이크로, 포아송 통계 두 개의 서로 다른 세포 유형 대 한 쌍을 1:1 셀 최적의 세포 농도에서 달성 될 수 있다 지시 한다. 푸아송 예측을 바탕으로, 또한 있다 확률 방울 다른 조합이 포함 될 수 있습니다. 1:1 셀 쌍 수 있지만 단일 셀 수준 및 증가 세포 이해에 결과에서 세포 상호 작용을 공부 하는 것이 좋습니다, 주요 이점이 있다 또한 여러 셀 페어링. 다른 셀 형식에 대 한 셀 형식의 여러 셀의 영향을 이해할 수 있습니다. 다른 면역 세포 간의 크로스 토크 여러 감염 및 병원 체에 대 한 효과적인 면역 반응을 생성 하는 데 도움이 하 고 또한 우리의 면역 시스템32에 견고성을 추가 합니다. 따라서, 셀룰러 통신 고유한 컨텍스트, 예를 들어, 1:1, 2:1, 1:2, 2:2, 3:1, 등에서 고정밀 심문 수 있습니다. 어떻게 단일에 저조한 증가 이해 또는 셀의 면역 반응의 유도 제어합니다. 이 특히 연구 예를 들어 순차적으로 세포를 죽 일 그들의 각각 대상 자연 킬러 세포 또는 세포 독성 T 세포의 용량 흥미롭습니다.

언급 했 듯이, 방울, 셀의 여러 캡슐화에 대 한 높은 셀 농도 원하는 됩니다. 그러나, 세포 샘플의 높은 농도 셀 캡슐화에 대 한 하나의 입구에서 세포를 로드할 때 셀 하면 입구에서 집계를. 이 결과 낮은 캡슐화 속도 이론에서 높은 편차. 이 문제를 피하기 위해, 셀 뿐만 아니라 두 개의 별도 후미에서 로드할 수 있습니다. 이론적으로, 그것은 셀 수 x에 평균 보증은 세포 캡슐화의 더 높은 수준을 달성 하기 위해 여러 개의 후미와 다른 미세 소자를 개발할 수 것입니다. 이 연구에서 우리는 하나의 입구와 같은 총 농도 사용 하 여 두 후미에서 로드 하 고 비슷한 캡슐화 효율을 얻은 Jurkat T 세포의 캡슐화 효율 조사. 이 수정 칩에 쌍 다른 세포 유형에 연구자를 수 있습니다.

이 메서드는 셀 셀의 상당한 손실 없이 미세 장치 로드에 에이즈, 동안 명심 될 필요가 있는 특정 예방 조치가 있다. 공기 방울의 미네랄 오일과 피 펫 팁에서 셀 샘플을 발음 주사기를 채울 때 피해 야 한다 하 고 전체 시스템 공기 무료. 그것은 또한 미네랄 오일 샘플 혼합 하지 해야 하는 것을 명심 하는 것이 중요입니다. 피 펫 팁, 포함 하는 샘플, 미세 장치와 누설 하 고 공기 방울의 추가 설립을 방지 하기 위해 최대한 예방의 후미에 단단히 삽입 한다. 요약 하면, 팁-로드 비용 효율적인 방식으로 셀의 상당한 손실 없이 세포 캡슐화를 통해 세포 행동의 높은 처리량 분석을 허용 하는 간단 하지만, 강력한 기술입니다. 입구에서 최적의 샘플 농도 함께 사용 하면 로드 셀 피 펫 팁의이 방법은 매우 유연 하며 다른 세포 유형, 특히 드문 기본 면역 세포에 대 한에 가까운 높은 캡슐화 효율를 위해 적응 시킬 수 있다 예측된 모델입니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 아인트호벤 공대 관대 한 지원에 대 한 감사합니다.

Materials

1H,1H,2H,2H-Perfluoro-1-octanol  Sigma-Aldrich 171468-5G
1H,1H,2H,2H-Perfluorooctyltriethoxysilane Fluorochem/UK S13150 Silane (toxic)
Agarose (Ultra-low Gelling Temperature) Sigma-Aldrich  9012-36-6
BD Wegwerpspuiten met Luer-Lok-punten Fisher Scientific 10630694 Syringe
Biopsy Punch 1.2 mm Harris Uni-Core
Cell Proliferation Dye eFluro 670 eBioscience 65-0840-85
CellTrace CFSE Invitrogen C34554
CellTrace Far Red Cell Invitrogen C34564
Eppendorf Tubes Eppendrof Tubes Safe-Lok tubes 1 mL and 2 mL
Glass Slide Sigma Aldrich CLS294775X38-72EA Corning microscope slides, plain L × W 75 mm × 38 mm
Harvard Pumps Harvard Apparatus C-400750; C-400727 Syringe pumps
HFE-7500 3M Novec Engineered fluid Fluorochem/UK 51243 Flourinated oil
Kai Biopsy Punch 5 mm Amstel Medical 1980130
Luer stub Instechlabs/USA LS20S Luer stub, 20ga (pink) x 0.5in (12mm), non-sterile
Mineral oil (Light) Sigma Aldrich M8410-1L
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-50TAB Tablets
Pico-Surf 1 (5%in Novec 7500) Sphere Fluidics 020317-09 Surfactant
Plasma Asher Emitech K1050X  Plasma asher
RPMI 1640 Medium Gibco 11875093
Silicone Elastomer Base 184 Sylgard 9355218 PDMS base
Silicone Elastomer Curing Agent  Sylgard 9355218 Curing Agent 
Stainless steel catheter coupler Instechlab/USA SC20/15 20ga x 15mm, non-sterile
TFE Teflon Tubing Sigma-Aldrich 58696-U PTFE Tubing  L × O.D. × I.D. 50 ft × 1/16 in. × 0.031 in.
Thinky mixer ARE-250 EX-4025F Conditioning mixture
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Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. A Pipette-Tip Based Method for Seeding Cells to Droplet Microfluidic Platforms. J. Vis. Exp. (144), e57848, doi:10.3791/57848 (2019).
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